ICS71.100.70 CCSY42 团体标准 T/ZGKSL009-2023 2023-09-21发布 2023-09-21实施重组胶原蛋白促人源细胞胶原蛋白分泌测定方法 Testmethodfordeterminationofcollagensecretedfromhumancells inducedbyrecombinantcollagen 中国抗衰老促进会发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/ZGKSL009-2023 I目 录 前  言...................................................................................................................................................................II 重组胶原蛋白促人源细胞胶原蛋白分泌测定方法................................................................................................1 1范围........................................................................................................................................................................1 2规范性引用文件....................................................................................................................................................1 3术语和定义............................................................................................................................................................1 4原理........................................................................................................................................................................1 5试剂、材料、仪器和设备....................................................................................................................................1 6试验步骤................................................................................................................................................................2 7结果分析和判定....................................................................................................................................................4 8试验报告................................................................................................................................................................5 参考文献........................................................................................................................................................6 全国团体标准信息平台 T/ZGKSL009-2023 II前  言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国抗衰老促进会提出并归口。 本文件起草单位：西安巨子生物基因技术股份有限公司、西北大学、中国科学院过程工程研究所、 江苏江山聚源生物技术有限公司、陕西省药品和疫苗检查中心。 本文件主要起草人：范代娣、史静静、段志广、张贵锋、徐丽明（原单位：中国食品药品检定研究 院）、丁亚芳、胡碧荣、徐茹、贾利平、赵婧、高建萍。 全国团体标准信息平台 T/ZGKSL009-2023 1重组胶原蛋白促人源细胞胶原蛋白分泌测定方法 1范围 本文件提供了重组胶原蛋白促进人皮肤成纤维细胞分泌的胶原蛋白的测定方法，包括蛋白水平及 mRNA水平的测定。 本文件适用于化妆品领域用重组胶原蛋白促进人皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白的功效评价。 注：其他人源细胞分泌胶原蛋白的测定可参考本文件给出的方法。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 YY/T1849重组胶原蛋白 《中华人民共和国药典》 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 重组胶原蛋白recombinantcollagen 采用重组DNA技术，对编码所需人胶原蛋白质的基因进行遗传操作和（或）修饰，利用质粒或病 毒载体将目的基因带入适当的宿主细胞（细菌、酵母或其他真核细胞等）中，表达并翻译成胶原蛋白或 类似胶原蛋白的多肽，经过提取和纯化等步骤制备而成。 [来源：YY/T1849,3.2] 4原理 胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，是动物体中普遍存在的一种大分子结构蛋白。人体内能够分泌 胶原蛋白的细胞有人皮肤成纤维细胞、成骨细胞和平滑肌细胞等。本文件以人皮肤成纤维细胞为例，给 出了重组胶原蛋白促进人源细胞分泌胶原蛋白的测定方法。 人皮肤成纤维细胞（HumanSkinFibroblast，HSF）具有分泌胶原蛋白的能力，采用添加重组胶原 蛋白的细胞完全培养液通过体外培养HSF，分别收集细胞培养的上清液及细胞，从蛋白水平（胶原蛋 白含量）和转录水平（mRNA）检测不同型别胶原蛋白的表达及分泌。HSF分泌的胶原蛋白（存在于细 胞培养上清液中）采用酶联免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）进行测定；收 集的HSF细胞中不同型别胶原蛋白转录水平mRNA的表达采用实时荧光定量PCR（RealTime QuantitativePCR，RT-qPCR）进行检测。从而评价重组胶原蛋白的促进人皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋 白的功效。 5试剂、材料、仪器和设备 全国团体标准信息平台 T/ZGKSL009-2023 25.1试剂和材料 主要试剂和材料如下： a）人皮肤成纤维细胞； b）DMEM培养基； c）胎牛血清； d）胰蛋白酶； e）青霉素-链霉素抗体； f）人I型、III型胶原蛋白ELISA检测试剂盒； g）RNA提取试剂盒； h）反转录试剂盒； i）荧光定量试剂盒； j）荧光定量PCR引物（包括I型、III型胶原蛋白基因、内参基因β-actin），引物序列见表1。 表1各种基因的引物序列 5.2仪器和设备 主要仪器和设备如下： a）分析天平，精确到0.1mg； b）细胞培养箱； c）倒置显微镜； d）酶标仪； e）离心机； f）基因扩增仪或相当设备； g）实时-荧光定量PCR仪。 6试验步骤 6.1样品制备 完全培养液组成：DMEM培养基、10%~20%的胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗。 受试物准备：采用HSF细胞完全培养液将重组胶原蛋白配制成所需浓度的供试品溶液。必要时可 制备高、中、低或系列剂量浓度，用于剂量–效应分析。 6.2细胞培养 采用0.25%胰蛋白酶将体外培养至对数生长期的HSF细胞消化1min~5min后，加入DMEM完 全培养基终止酶消化，收集细胞1000rpm，5min离心，将其接种于细胞培养板中。参考的细胞接种密基因名称 引物序列 COL1A1F：AATGAAGGGACACAGAGGTTTCA R：AGCACCAGTAGCACCATCATTTC COL3A1F：TTCTGCCATCCTGAACTCAAGAG R：ACGTGTTTCTTCTCAGCACTAGA β-actinF：GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG R：ATGTCCACGTCACACTTCATGAT 全国团体标准信息平台 T/ZGKSL009-2023 3度为48孔板：3×104个/孔，5