ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35338—2017 大豆茎褐腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Cadophora gregata (Allington & D.W.Chamb.) T.C.Harr. & McNew 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35338—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民 共和国福建出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：陈枝楠、王念武、杜洪忠、王颖、吴品珊、程颖慧、汪莹、章桂明、李芳荣 GB/T 35338—2017 大豆茎褐腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了大豆茎褐腐病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于大豆茎褐腐病菌的寄主携带大豆茎褐腐病菌的检疫鉴定。 2病菌的基本信息 2 学名:Cadophora gregata （Allington &.D.W.Chamb.)T.C.Harr.&.McNew 异名:Cephalosporium gregatum Allington &D.W.Chamb.,Phialophora gregata （Allington & D.W.Chamb.) T.C.Harr.&.MeNew 分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），散囊菌纲（Eurotiomycetes），刺盾目（Chae tothyriales),Herpotrichiellaceae 科。 大豆茎褐腐病菌有2个寄主专化型，即大豆茎褐腐病菌大豆专化型C.gregataf.sp.sojae和大豆 茎褐腐病菌赤豆专化型C.gregataf.sp.adzukicola，二者在形态和生理特征上没有明显区别，主要为 DNA序列和寄主的差异，赤豆茎褐腐病菌侵染赤豆不侵染大豆，而大豆茎褐腐病菌侵染大豆不侵染赤 豆。根据DNA序列和症状上的差异，大豆茎褐腐病菌大豆专化型C.gregataf.sp.sojae又被分成两 种基因型，A型和B型。 传播途径：大豆茎褐腐病菌主要通过其寄主植物茎秆残体进行远距离传播 大豆茎褐腐病菌的其他信息参见附录A，序列信息参见附录B。 3方法原理 根据大豆茎褐腐病菌的培养性状、形态学特征和分子生物学特征为判断依据。 仪器和器具 41 4.1仪器 主要使用的仪器包括：生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、 冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、摇床。 4.2器具 片、盖玻片、塑料研杆、移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐。 5试剂和培养基 5.1试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 1 GB/T35338—2017 主要使用的试剂包括：琼脂粉、马铃薯、葡萄糖、乳酸、琼脂糖、无菌双蒸水、液氮、硫酸铜、五氯硝基 苯、次氯酸钠、琼脂糖、十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、氯化镁、盐酸、乙二胺四乙酸四 钠盐、氢氧化钠、氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、十六烷基三甲基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷乙酸缓冲液、无 水乙醇、苯酚、氯仿、异丙醇、异戊醇、蛋白酶K、PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs(dATP、dTTP、 dCTP、dGTP)、DNA分子量 Marker、PCR引物 BSRIGS1和 BSRIGS2。 5.2培养基 本方法所用的培养基参见附录C。 6检疫鉴定方法 6.1症状检查 田间大豆植株上选择叶片有不同程度萎焉、褪绿的植株，切开植株茎秆部位，观察茎秆内部是否有 褐变。大豆种子中主要挑选其夹带的茎秆残体，切开茎秆检查内部是否褐变。具体症状参见附录A。 6.2分离培养 将疑似大豆茎秆或茎秆残体，在病健交界处剪取小块2mm～5mm，用0.5%次氯酸钠表面消毒 养，3d~5d后开始观察。 6.3形态学鉴定 如在选择性培养基上观察到真菌菌落的形成，转接到GBA和PDA培养基上，20℃黑暗培养，5d 后开始观察记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子的形状和大小。 6.4分子生物学鉴定 6.4.1DNA提取 收集病残体或分离到的真菌菌丝，CTAB法提取核酸，参见附录D。 6.4.2PCR特异性检测 特异性引物BSRIGS1和BSRIGS2的序列（引自ChenWeidongetal，2000）分别为5’-GGGGT 反应体系（25μL)：样品DNA1μL,10XPCRbuffer2.5μL,2.5mmol/LMgCL22.5μL, 2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL,10 μmol/L Primers 各 0.5 μL,5 U/μL Taq DNA polymerase 0.2 μL, ddH,0 15.3 μL。 以灭菌去离子水作空白对照，以大豆茎褐腐病菌的DNA作为阳性对照，以大豆上其他病菌的 DNA作为阴性对照，每个样品重复2次。 72 ℃ 5 min。 在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，EB染色，凝胶成像仪分析结果。 2