ICS 65.020.20 B 33 备案号：35826-2013 青 海 DB63 省 地 方 标 准 DB 63/T 1159—2012 甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR 操作规程 2012 - 12 - 04 发布 青海省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB63/T 1159—2012 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。 本规程起草单位:中国科学院西北高原生物研究所、青海省种子管理站。 本规程主要起草人：李毅、胡延萍、宋晓荭、彭秉玉、王莉、王焕强、巩爱岐、包天忠、王溪、冯 承彬。 I DB63/T 1159—2012 甘蓝型杂交油菜品种纯度检验 ISSR 操作规程 1 范围 本规程规定了甘蓝型杂交油菜（Brassica napus L.和 Brassica campestris L.）品种纯度ISSR 指纹鉴定的术语和定义、设备与耗材、试剂及溶液的配制、操作程序、判定原则及报告等技术内容。 本规程适用于各级科研、推广、生产单位和种子部门等在甘蓝型杂交油菜品种纯度检验时使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.1 农作物种子检验规程 总则 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 聚合酶链式反应 （以下简称 PCR） 一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 3.2 引物 一条互补结合在模板DNA链上的短的单链，在3′-OH端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补 链。 3.3 简单重复序列区间 （以下简称 ISSR） 根据某个简单重复序列（微卫星位点）作为特异引物，通过PCR反应扩增模板DNA链上微卫星位点 间隔的碱基序列。 4 设备与耗材 1 DB63/T 1159—2012 4.1 设备 ——高速低温离心机； ——PCR 扩增仪； ——多用电泳仪及水平式电泳槽； ——紫外凝胶成像系统； ——微量移液器：规格为 0.2L-2L，1L-10L，2L-20L，5L-50L，20L-200L，200L-1000L； ——电子分析天平； ——磁力加热搅拌器； ——蒸汽压力灭菌锅； ——恒温水浴锅； ——微波炉。 4.2 耗材 ——离心管：0.2mL，1.5mL，2.0mL； ——研钵； ——移液器吸头：20L，200L 和 1000L； ——烧杯； ——三角烧瓶； ——PE 手套：一次性聚乙烯手套。 5 5.1 试剂及溶液的配制 试剂要求 试剂需使用分析纯级。配制试剂所使用的水，除另有说明外，使用按GB/T 6682规定的一级水。 5.2 试剂 ——CTAB: 十六烷基三甲基溴化胺； ——β-巯基乙醇； ——Tris：三羟甲基氨基甲烷； ——PVP：聚乙烯吡咯烷酮碘络合物； ——Taq E：DNA 聚合酶，附带 6 倍 loading buffer、10 倍 buffer 和 25.0mmol/L MgCl2； ——dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸； ——λDNA/Hind Ш marker ——100bp 或 200bp DNA marker； ——EB：溴化乙锭 ——10 倍 buffer：10 倍反应缓冲液； ——氯化镁； ——6 倍 loading buffer：6 倍上样缓冲液； ——Primer：引物； ——EDTANa2 2H20：乙二胺四乙酸二钠； ——ddH2O：经高压灭菌的二次蒸馏水； ——氯化钠； 2 DB63/T 1159—2012 ——氢氧化钠； ——无水乙醇； ——氯仿； ——异戊醇； ——异丙醇； ——盐酸； ——醋酸； ——石英砂； ——琼脂糖。 5.3 溶液的配制 见附录A。 6 操作程序 6.1 植物样品准备 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.2 受检样品种子的扦样、分样和保存，按 GB/T 3543.2 的规定执行。 测试样品的数量及淘汰值按 GB/T 3543.5 中的规定执行，见附录 E。 种子按 GB/T 3543.4 规定的方法发芽，取苗龄一周的叶片提取基因组 DNA。 DNA 样品提取 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) 6.3 将 2 倍 CTAB 提取缓冲液在 65℃水浴中预热。 取新鲜叶片约 20mm2 放入研钵中，加少许石英砂和 PVP 干粉迅速研磨。 将所得研磨物转入 2.0mL 离心管中，加入 900µL 预热的 2 倍 CTAB 提取缓冲液， 65℃水浴保 温 30min，每隔 10min 将离心管上下轻轻摇匀。 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管 10min 使其充分混匀，置于高速低温离心机中， 10000r/min 离心 10min，取上清液转移至另一个 1.5mL 离心管。 重复第 d)步。 在上清液中加入 2/3 体积预冷至-20℃的异丙醇，将离心管轻轻摇匀，置于-20℃的冰箱中放置 30min，或者过夜。 高速低温离心机 10000r/min，4℃离心 6min， 弃上清液。 加入 75%的乙醇 500µL，高速低温离心机 10000r/min 离心 5min，弃上清液。 重复第 h)步， 置于 37℃或者室温下自然风干。 按本规程 6.3 和 6.4 提供的方法，加入 ddH2O 溶解 DNA，使溶液的 DNA 浓度至 40.0ng/L。DNA 样品置于 4℃下待用，或-20℃下储存。 DNA 样品质量检测 同时使用下述两种方法对DNA样品进行质量检测，若检测结果不符合两者中的任一要求，应重新提 取DNA。 a) 取 40µL DNA 样品稀释 50 倍，用紫外分光光度计测定其 A260 值和 A280 值。A260/A280 的比值 应在 1.6 - 2.0 之间。 3 DB63/T 1159—2012 b) 6.4 按照附录 A.8 制备 0.80%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，点样孔处于电泳负极端，小心拔下梳子， 加入 1 倍 TAE 缓冲液并没过胶面约 1.0mm。取 4µL DNA 样品和 1µL 6 倍 loading buffer 混匀， 加到点样孔中，在另一点样孔中加入 λDNA/Hind Ш marker，电压 3 V/cm - 5V/cm，进行电泳 检测。紫外凝胶成像系统下观察，DNA 样品应在 23kb 处有一条清晰的条带。 DNA 浓度计算 DNA样品浓度按公式（1）计算，单位：ng/µL。 DNA样品浓度=A260×50 ng/µL×稀释倍数 ............................ (1) 6.5 PCR 扩增 6.5.1 反应体系 反应液体积为20.00µL，组分配制应符合表1的规定。 表1 反应组分 PCR 扩增反应体系 原浓度 终浓度 ddH2O 13.80L 10 倍 Buffer 10 倍 1.250 倍 2.50L MgCl2 25.0mmol/L 1.500 mmol/L 1.20L dNTP 2.5mmol/L 0.125 mmol/L 1.00L 引物 10.0mol/L 0.200mol/L 0.40L Taq E 5.0U/L 0.025U/L 0.10L DNA 样品 40.0ng/L 2.000ng/L 1.00L 合计 6.5.2 反应体积 20.00L 反应程序 PCR扩增程序如图1所示，其中X℃为选用引物的退火温度，见附录B.2： 94℃预变性 5min 94℃变性 20s X℃退火 1min 38 个循环 72℃延伸 80s 72℃延伸 6min 4℃冷却保存 图1 PCR 扩增反应程序图 4 DB63/T 1159—2012 6.5.3 PCR 扩增产物的检测 按照附录A.8制备1.50%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，点样孔处于电泳负极端，取下梳子，加入1倍 TAE缓冲液并没过胶面约1.0mm。取10L PCR扩增产物和1µL 6倍loading buffer混匀，加到点样孔中， 在另一点样孔中加入4 µL 的100bp或200bp DNA marker，电压3 V/cm - 5V/cm，进行电泳检测。电泳 结束后，琼脂糖凝胶放入紫外凝胶成像系统，拍照记录。 6.5.4 数据记录 对凝胶成像结果进行人工读带，同一引物的扩增产物其电泳迁移率一致的条带为同一位点。各位点 按条带阳性为1、条带阴性为0，记录电泳带谱，排除其中模糊不清的带和无法准确标记的带。对每个样 品的扩增条带进行记录。 6.5.5 引物选择 从加拿大British Columbia大学设计的100个ISSR引物中，序列见附录B.1，筛选扩增条带清晰、重 复性好的引物。推荐使用的13条引物及其序列见附录B.2。优先使用推荐类型的3条引物，若未获得确 定结果，再依次增加推荐类型的其他引物。 7 7.1 判定原则 标准数据库的建立 7.1.1 按本规程 6.5.5 选定引物； 7.1.2 对标准品种的种子按照本规程的规定进行扩增和记录。标准品种的种子其真实性应准确无误； 7.1.3 标准品种应至少涵盖：目标品种及其父本和母本、亲缘关系较近的杂交品种及其父本和母本、 甘蓝型油菜常规品种和白菜型油菜常规品种。各品种应记录 13 个-20 个种子的测定数据。 7.1.4 测定数据按 NTSYSpc 软件的要求，建立数据矩阵。用 NTSYSpc 软件中按 SM 遗传相似系数进行 UPGMA 聚类； 7.1.5 如各品种可以独自聚为一组，该矩阵即为标准数据库； 7.1.6 如部分品种不能单独聚为一组，应按本规程 6.5.5 的规定增加引物进行测定和计算，直至符合 本规程 7.1.5 的要求。 7.1.7 附录 C 为推荐类型 I 的 3 条引物对青杂 2 号、3 号、5 号及其各自父本和母本，青油 14 号和浩 油 11 号油菜品种进行扩增建立的标准数据库。 7.2 标准数据库的补充与修改 选取新品种及其父本和母本的标准种子，标准种子的真实性应准确