(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210660248.5 (22)申请日 2022.06.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114752677 A (43)申请公布日 2022.07.15 (73)专利权人 北京思诺普斯 生物科技有限公司 地址 102206 北京市昌平区生命科 学园生 命园路29号C003-08室 (72)发明人 姚嘉　 (74)专利代理 机构 北京华沛德权律师事务所 11302 专利代理师 房德权 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) 审查员 张维捷 (54)发明名称 一种快速检测IDH1突变的引物组、 试剂盒及 扩增方法和应用 (57)摘要 本申请涉及基因检测领域， 尤其涉及一种快 速检测IDH1突变的引物组、 试剂盒及扩增方法和 应用； 所述引物组包括IDH1  R132H基因突变 型探 针、 IDH1 R132L基因突变型探针、 IDH1  R132C基 因突变型探针、 IDH1  R132G基因突变型探针和 IDH1 R132S基因突变 型探针； 所述试剂盒包 括引 物组， 所述扩增方法包括： 提取离体胶质瘤组织 样品； 对所述胶质瘤组织样品进行前处理， 得到 含目的基因的样品浆液； 向试剂盒中加入样品浆 液和磁珠溶液， 后进行PCR扩增反应， 得到纯化的 扩增产物； 所述应用包括： 将引物组用于制备临 床检测IDH1突变位点的检测试剂中； 在同个试剂 盒中经过一轮 检测就能将所有突变 类型检出。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图4页 CN 114752677 B 2022.09.02 CN 114752677 B 1.一种试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括IDH1基因引物组、 IDH1基因探针组、 内标 基因引物组、 内标基因探针、 卡盒体(1)、 磁珠溶液、 扩增反应液， 所述试剂盒用于缩短IDH1 突变基因的PCR扩增时间； 其中， 所述 IDH1基因引物组的碱基序列如下 所示： IDH1基因上游引物： 5' ‑AACAACAAAATCAGTTGCTCT‑3' IDH1基因下游引物： 5' ‑AACAAATGTGGAAATCACCAAA‑3'； 所述IDH1基因探针组的碱基序列如下 所示： IDH1 R132H基因突变型探针： 5' ‑ATCCCCATAAGCATTAT‑3' IDH1 R132L基因突变型探针： 5' ‑ATCCCCATAAGCATAAA‑3' IDH1 R132C基因突变型探针： 5' ‑ATCCCCATAAGCATGGCA‑3' IDH1 R132G基因突变型探针： 5' ‑ATCCCCATAAGCATGTC C‑3' IDH1 R132S基因突变型探针： 5' ‑ATCCCCATAAGCATGGCT‑3'。 2.根据权利要求1所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述内标基因引物组包括内标基因上游 引物、 内标基因下游引物， 所述内标基因上游引物的序列如SEQ  ID NO.8所示， 所述内标基 因下游引物的序列如SEQ  ID NO.9所示， 所述内标基因探针的序列如SEQ  ID NO.10所示。 3.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述IDH1  R132H基因突变型探针、 所述 IDH1 R132L基因突变型探针、 所述IDH1  R132C基因突变型探针、 所述IDH1  R132G基因突变 型探针和所述IDH1  R132S基因突变型探针的3'端都设有淬灭基团， 所述淬灭基团包括 TAMRA、 BHQ或MGB。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述卡盒体(1)设于所述试剂盒内， 所述 卡盒体(1)设有分隔区和阻断柱(14)， 所述分 隔区包括裂解区(11)、 清洗区(12)和扩增反应 区(13)， 所述裂解区(11)的出料口连通所述清洗 区(12)， 所述清洗 区(12)的进料口连通所 述扩增反应区(13)， 所述裂解区(11)、 所述清洗 区(12)和所述扩增反应区(13)之间分别 通 过所述阻断柱(14)分隔开， 所述阻断柱(14)内设有纵向通道， 以实现对分隔区的封锁； 所述扩增反应区(13)用于承载扩增反应液， 所述扩增反应液含有所述IDH1基因引物 组、 IDH1基因探针组、 内标基因引物组和内标基因探针。 5.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述 卡盒体(1)还 包括： 加样口(2)， 所述加样口(2)设于所述试剂盒的顶部； 卡盒盖(3)， 所述卡盒盖(3)设于所述试剂盒的顶部， 用于实现对加样口(2)的单向封 闭， 所述卡盒盖(3)和所述加样口(2)之间设有封口膜(4)  。 6.一种非诊断目的的试剂 盒的使用方法， 其特征在于， 使用如权利要求1 ‑5任一项所述 的试剂盒， 所述使用方法包括： S1. 提取预设重量的离体胶质瘤组织样品； S2. 对所述胶质瘤组织样品进行 前处理， 得到含目的基因的样品浆液； S3. 向所述试剂盒卡盒体(1)中加入所述样品浆液和磁珠溶液， 后进行PCR扩增反应， 得到纯化的扩增产物； 其中， 所述预设重量 为2.5mg～5.0mg。 7.根据权利要求6所述非诊断目的的试剂 盒的使用方法， 其特征在于， 所述样品浆液和 所述磁珠 溶液的体积之比为19:1～ 20:1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752677 B 2一种快速检测IDH1突变的引物组、 试剂盒及扩增方 法和应用 技术领域 [0001]本申请涉及基因检测领域， 尤其涉及一种快速检测IDH1突变 的引物组、 试剂盒及 扩增方法和应用。 背景技术 [0002]人类IDH基因有三种类型， 分别为IDH1、 IDH2和IDH3， 但仅IDH1定位与细胞质和过 氧化物酶体中发挥主要作用， IDH2和IDH3定位与线粒体中， 因IDH1基因所编码的蛋白名为 人异柠檬酸脱氢酶 （IDH1） ， 该类蛋白酶可以将异柠檬酸氧化为草酰琥珀酸， 然后再转化为 α‑酮戊二酸。 目前大量研究发现IDH1的突变与多种肿瘤密切相关， 如肝内胆管癌、 软骨肉 瘤、 甲状腺癌、 前列腺癌、 副神经节瘤、 急性髓细胞性白血病和脑胶质瘤等， 其致瘤机制为突 变的IDH1能将α ‑酮戊二酸转化为2 ‑羟戊二酸， 然后在细胞内积累， 后者可以抑制前者的靶 点， 导致这些靶点表达异常从而引发癌症。 [0003]IDH1/2基因突变主要发生在低级别胶质瘤细胞中， 约60%～80%的 Ⅱ级和Ⅲ级胶质 瘤以及高达90%继发性胶质母细胞瘤存在有IDH基因突变， 在胶质瘤中， IDH1突变频率远高 于IDH2的突变频率， 超过  90% 的 IDH 基因突变为  IDH1 突变， 而在IDH1突变中几乎所有 类型均为R132位点 （包括R132H、 R132C、 R132L、 R132S、 R132G等） ， 除此之外IDH1/2而IDH1最 主要的突变类型为R132H突变， 占全部突变类型的80%以上， 是最关键的IDH突变位点， 也是 多种肿瘤的重要分型 标记物。 [0004]目前肿瘤等疾病相关突变位点的基因检测是通过血液、 体液或组织细胞对DNA进 行检测的技术， 随着基因测序技术 发展， 临床上基因突变检测的金标准是二代测序法， 此方 法的优点是实验方法简单， 结果直观可靠， 成本较低， 但该技术检测灵敏度较不高， 且检测 周期较长， 通常从临床样本获取到检测报告回复至少需要1 ‑2周时间； 而随着荧光定量PCR   技术的发展， 出现了越来越多的基于PCR的基因检测试剂盒产品， 相比二代测序法， 荧光P CR 技术仅需2小时即可 得到检测结果， 灵敏度高， 具有明显的优势。 [0005]由于现阶段的荧光定量PCR检测需要采用在专业仪器上进行， 而目前针对IDH1   R132的突变位点的检测， 大部分是针对某一类或某几种突变进行检测， 因此需要多次的荧 光定量PCR检测才能得到整个IDH1  R132的突变位点信息， 而对IDH1  R132所有突变位点的 检测需要在多个设备上和专门的检测人员进 行检测， 操作较为繁琐， 难以在临床上应用； 因 此如何能全面检测IDH1  R132所有的突变位点， 以实现在临床上检测IDH1  R132所有的突变 位点， 是目前亟需解决的技 术问题。 发明内容 [0006]本申请提供了一种快速检测IDH1突变的引物组、 试剂盒及扩增方法和应用， 以解 决现有技 术中荧光定量PCR检测难以全面检测IDH1  R132所有的突变位 点的技术问题。 [0007]第一方面， 本申请提供了一种快速检测IDH1突变的引物组， 所述引物组包括IDH1 基因组引物， 所述IDH1基因组引物包括IDH1  R132H基因突变型探针、 IDH1  R132L基因突变说　明　书 1/11 页 3 CN 114752677 B 3