ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 18641—2018 代替GB/T18641—2002 伪狂犬病诊断方法 Diagnostic method for pseudorabies 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 18641—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18641—2002《伪狂犬病诊断技术》。与GB/T18641—2002相比，主要技术变化 如下： —增加了检测猪伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA方法； 一增加了检测伪狂犬病病毒野毒gE-PCR方法。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：华中农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：何启盖、库旭钢、吴斌、陈品、方六荣、李晓成、姜雯、孟宪荣、范盛先、刘正飞、 吴发兴、吴美洲、陈焕春、 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18641—2002。 1 GB/T186412018 引言 伪狂犬病（Pseudorabies，Pr；Aujeszkysdisease，AD）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus， PrV)引起的一种多种动物共患传染病，可危害猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小鼠、狐狸和浣熊等多种动物，呈 世界性分布。该病对养猪业的危害最为严重，病毒感染后，妊娠母猪出现流产、产死胎和木乃伊胎； 15日龄内仔猪出现神经症状，致死率100%；断奶仔猪出现神经症状和呼吸道症状，致死率10%～ 出现睾丸炎性肿胀或萎缩，失去种用能力。除猪外，其他动物感染伪狂犬病病毒后，可出现体温升高、奇 痒和脑脊髓炎等临床症状，最终死亡，但呈散发形式。 本标准规定的常规血清学技术可用于非免疫动物的诊断、血清流行病学调查和免疫动物抗体检测。 其中，中和试验特异性强，是国际贸易中通用的法定方法，用于口岸进出口检疫；乳胶凝集试验简便快 速、敏感性高，适用于基层单位对该病的现场检测和筛查；酶联免疫吸附试验（ELISA)包括全病毒抗原 ELISA（PrV-ELISA）和gB-ELISA方法，适用于实验室开展大批血清样品抗体检测。本标准中的gE- ELISA鉴别诊断方法，可区分伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗免疫猪和自然感染猪，因此，可用于猪群 野毒感染的诊断和流行病学调查。本标准中规定的3种ELISA方法仅用于检测猪血清中的伪狂犬病 病毒抗体，不适用于检测其他动物血清中伪狂犬病病毒抗体 本标准规定的病原学诊断方法用于检测死亡和部检动物的病料、流产胎儿组织（如扁桃体、肺脏和 脑组织等）、活体动物的扁桃体、鼻拭子和公猪精液中的伪狂犬病病毒。其中，病毒分离鉴定限于有条件 的实验室使用，聚合酶链式反应具有快速和灵敏的特点，可同时检测大批样品，但需注意样品交叉污染。 家兔接种试验需在有隔离和消毒条件的动物房中进行。 Ⅱ GB/T 18641—2018 伪狂犬病诊断方法 1范围 本标准规定了伪狂犬病的血清中和试验、乳胶凝集试验、伪狂犬病病毒抗体ELISA（PrV-ELISA）、 猪伪狂犬病gB-ELISA（阻断法）和gE-ELISA（阻断法）等抗体检测方法及病毒分离鉴定、聚合酶链式反 应和家免接种试验等病原检测方法。 本标准适用于猪、牛、羊、犬、猫及其他易感动物的伪狂犬病诊断、检疫、免疫抗体评估和流行病学调 查等。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T678 猪伪狂犬病免疫酶试验方法 血清中和试验（采用固定病毒稀释血清法） 3 3.11 仪器 3.1.1二氧化碳培养箱。 3.1.2 生物安全柜。 3.1.3 微量移液器。 3.2 2耗材 3.2.1 细胞培养瓶。 3.2.2 96孔细胞培养板。 3.2.3 吸管。 3.2.4 移液器吸头。 3.3试剂 3.3.1DMEM培养液（见附录A）。 3.3.2 0.25%胰酶（见附录A）。 3.3.3 PK-15细胞。 3.3.4伪狂犬病阳性血清。 3.3.5阴性血清。 3.3.6 伪狂犬病病毒（野毒株）。 1 SAG GB/T18641—2018 3.4操作步骤 3.4.1病毒半数细胞培养物感染量（TCID5o）的测定 3.4.1.1病毒培养和收获 将伪狂犬病病毒（野毒株）接种于长成单层的PK-15细胞，接种量为液体培养基的1/10体积，37℃ 培养，待出现病变后，将细胞培养物冻融，离心去除细胞碎片，收获病毒。 3.4.1.2病毒效价测定 释度取100μL加人96孔细胞培养板中。每个病毒稀释度接8个孔。 宜）。设非接毒、加等量DMEM的正常细胞培养对照。 3.4.1.2.3细胞96孔板置37℃、5%CO，培养箱中培养。 3.4.1.2.4逐日观察接毒细胞的病变，观察4d～5d，记录每个病毒稀释度接种细胞的细胞病变（CPE） 孔数。在观察期内，未接种病毒的细胞应无CPE。 3.4.1.3TCID5o计算 按照Reed-Muench法计算病毒的TCIDso（见附录B）。 3.4.2血清中和抗体效价的测定 3.4.2.1血清灭活 将无溶血、清亮的待检血清置于56℃水浴，灭活30min。 3.4.2.2血清稀释 在细胞培养板孔中加入50μLDMEM培养液，随后在第1孔中加入待检血清50uL混匀后，用微 合液弃去50μL），血清稀释度即为1：2、1：4、1：8~1；1024，每份待检血清稀释度作4个重复 3.4.2.3加入病毒 将50μL含200个TCIDso的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，37℃作用1h。 3.4.2.4接种细胞 每孔中加人100μLPK-15细胞悬液（细胞含量以3×105个/mL～5×105个/mL左右为宜），置 37℃、5%CO2培养箱中培养。 3.4.2.5设立对照组 3.4.2.5.1病毒对照组 每次试验均应设病毒对照。将200TCIDso病毒液作10倍、100倍、1000倍稀释。每孔加入50μL 不同稀释度的病毒液、50μLDMEM培养液和100μLPK-15细胞悬液。每个稀释度病毒4个重复。 3.4.2.5.2血清对照组 用已知中和效价的阳性血清、阴性血清与相同滴度的病毒孵化后，接种PK-15细胞；同时设正常培 养的细胞对照。 2 GB/T18641—2018 3.4.2.6结果观察 逐日观察，记录病变和非病变的孔数，共观察4d～5d。1000倍稀释病毒（0.2TCID50）对照组不 引起细胞病变，100倍稀释病毒（2TCIDso）对照组应有0～2孔细胞病变，10倍稀释病毒（20TCID50）对 照组均应有细胞病变；阳性血清、阴性血清和正常细胞对照成立，待检血清对PK-15细胞应无毒性，测 定结果方有效，否则该试验不成立。 3.4.2.7结果判定 按照Reed-Muench方法（见附录B)计算抗体效价，如血清中和效价≥1：2，可判定为伪狂犬病抗 体阳性。 4乳胶凝集试验 4.1仪器 10μL~50μL微量移液器。 4.2 2耗材 4.2.1移液器吸头。 4.2.2洁净干燥载玻片。 4.2.3 洁净牙签。 4.3试剂 4.3.1 伪狂犬病病毒乳胶凝集抗原（使用前轻轻摇匀）。 4.3.2 伪狂犬病阳性和阴性血清，稀释液（见附录C）。 4.4操作步骤 4.4.1对照试验 取等量的乳胶凝集试验抗原（约20μL)分别与阴性血清、阳性血清在洁净的玻片上混合，混合液直 径以不超过1.0cm为宜。如阴性血清与抗原混合后不出现凝集，而阳性血清与抗原混合后出现相当于 或高于50%凝集程度，则对照试验成立。 4.4.2待检血清处理 待检血清不必经热灭活或其他方式灭活，但应清亮透明，无溶血。 4.4.3待检血清的检测 将待检血清用稀释液倍比稀释后，各稀释度取15uL～20μL与等量胶乳凝集抗原在洁净干燥的载 玻片上用牙签搅拌充分混合，混合液直径以不超过1.0cm为宜。静置，在1min～3min内观察混合液 的凝集现象。 4.4.4判定标准 100%凝集程度：混合液透亮，凝集颗粒聚集在液滴的边缘。 75%凝集程度：混合液透明，出现大的凝集颗粒。 3 GB/T18641—2018 50%凝集程度：混合液略浑浊，凝集颗粒较细。 25%凝集程度：混合液浑浊，有少量凝集颗粒。 不凝集：待检血清与抗原混合后，呈浑浊状态，无可见凝集颗粒。 4.4.5结果判定 4.4.5.1待检血清倍比稀释后，分别与抗原混合，如出现50%凝集程度，该血清判为伪狂犬病抗体阳 性，否则判为抗体阴性。以出现50%凝集程度的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。 4.4.5.2本方法检测感染或免疫后产生的早期抗体IgM。当IgM消失后，本方法检测为阴性。此时， 可用3.4.2血清中和试验（适用于所有动物待检血清检测）”或5.2或5.3或5.4的“酶联免疫吸附试验 检测（仅适用于猪血清）”，可能出现以下3种结果： a）任何一种方法为阴性，判为伪狂犬病抗体阴性； b) 任何一种方法为可疑，建议在间隔2周后再用血清中和试验或ELISA检测，如这两种方法均 为阴性或可疑，判为阴性； c)I 血清中和试验和酶联免疫吸附试验均为阳性或某一种方法为阳性，判为伪狂犬病病毒抗体 阳性。 5酶联免疫吸附试验 5.1 抗体检测项目分类 本试验包含检测猪伪狂犬病病毒抗体ELISA（PrV-