ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 34796—2017 水溶液中核酸的浓度和纯度 检测 紫外分光光度法 Quantification and purity analysis of nucleic acid concentration in solution-Ultraviolet spectrophotometry 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34796—2017 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 究院、四川中测生物科技有限公司。 本标准主要起草人：谭和平、周李华、许丽、刘刚、马丽侠、李妍、叶德萍、梁文、王智、丁敏、孙登峰。 GB/T34796—2017 水溶液中核酸的浓度和纯度 检测紫外分光光度法 1范围 本标准规定了使用紫外分光光度法检测水溶液中核酸的浓度和纯度的原理、样品制备及检测方法。 本标准适用于水溶液中核酸的浓度和纯度检测，可对浓度在5ng/μL及以上的水溶液核酸样品定 量检测和纯度分析。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T11165实验室pH计 GB/T26813双光束紫外可见分光光度计 JJG646移液器检定规程 3 缩略语 SAC 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) 4原理 核酸中嘌岭和嘧啶碱基有共轭双键，具有吸收紫外光的性质，其最大吸收值在波长为250nm 270nm之间。碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，最大吸收波长约260nm，吸收 低峰在230nm。在波长260nm处，1单位OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/mL、单链 DNA及RNA为40μg/mL、单链寡核苷酸为33μg/mL，利用此量和浓度关系，可用于计算核酸样品 的浓度。 5 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1DNA标准溶液 小牛胸腺DNA标准溶液 5.2 2三羟甲基氨基甲烷缓冲液（1mol/LTris-HCI·pH7.4） 称取121.1gTris置于1L烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，用NaOH调节pH值 1 GB/T34796—2017 定容至1L，分装后在103kPa（1.05kg/cm²）高压蒸汽灭菌20min，室温保存，备用。 5.3EDTA(500 mmol/L-pH 8.0) 称取186.1gNa2EDTA·2H,O，置于1L烧杯中，加人约800mL的去离子水，充分搅拌，用 NaOH调节pH至8.0（pH至8.0时，EDTA才能完全溶解），定容至1L，分装后在103kPa （1.05kg/cm）高压蒸汽灭菌20min，室温保存，备用。 5.4TE缓冲液（10×TEBuffer·pH7.4) 量取100mL1mol/LTris-HCl（pH7.4)，20mL500mmol/LEDTA(pH8.0)置于1L烧杯中 加人800mL去离子水，混合均匀，定容至1L，分装后在103kPa（1.05kg/cm）高压蒸汽灭菌20min， 室温保存，备用。 6主要仪器、设备 6.1紫外分光光度计或核酸蛋白测定仪，应符合GB/T26813的要求。 6.2漩涡器 6.3电子天平：精度分别为0.1mg、0.01mg 6.4pH计，0.1级，应符合GB/T11165的要求 6.5 7样品制备 将适量核酸样品溶解于无菌水或TE溶液中，稀释至工作曲线范围内供测定。 8吸光度检测核酸浓度和纯度 8.1 仪器设置条件和程序 8.1.1核酸浓度检测 检测波长：260nm。 8.1.2核酸纯度检测 检测波长：260nm、230nm、280nm。 8.2测定 取适量核酸溶液（溶液体积根据仪器要求）检测，以稀释溶液调零，根据波长260nm、230nm、 280nm处核酸的吸光度，计算DNA双链、DNA单链和RNA的浓度，根据OD260/OD28和OD260/ OD230比值判断核酸纯度。重复测定3次取平均值。核苷三磷酸的特性参见表A.1及纯化的DNA的 分光光度测定结果参见表B.1。 8.3结果计算 8.3.1核酸浓度检测结果计算 核酸浓度按照以下公式计算： 2