ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 33117—2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Helgardia herpotrichoides 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 33117—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、青岛检验检疫技术发展中心、中华人民 共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局 本标准主要起草人：吴兴海、王英超、余冬冬、封立平、厉艳、纪瑛、甘琴华、吴翠萍、邵秀玲、王振华。 I GB/T33117—2016 小麦基腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了小麦基腐病菌的检疫鉴定方法 本标准适用于小麦属、黑麦属等禾本科寄主中小麦基腐病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 3小麦基腐病菌基本信息 学名:Helgardia herpotrichoides (Fron) Crous & W. Gams 2003 异名：无性态Cercosporella herpotrichoides Fron1912，Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron）Deighton1973.,Ramulisporaherpotrichoides（Fron）Arx1983；有性态Tapesiayallundae var. yallundae,Oculimacula yallundae (Wallwork &. Spooner) Crous & W. Gams 2003。 传播途径：主要以病残体混于种子间进行远距离传播。 小麦基腐病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方法的主要 依据。 5仪器设备和主要试剂 5.1仪器设备 生物显微镜、电子天平（感量0.001g）、离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、恒温水浴锅、涡旋 振荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、全自动DNA 提取仪。 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 表面活性剂吐温-20、琼脂、青霉素、链霉素、0.5%次氯酸钠（NaCIO）。 1 GB/T33117—2016 6现场检疫 按照SN/T2589，仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状（参见附录A）。对 可疑植物病残体和土壤应取样送实验室做进一步检验，取样方法和步骤按照SN/T2122。 7实验室检疫 7.1症状检查 小麦基腐病菌主要引起鞘枯和叶枯，病斑多在地际到10cm之间的叶鞘和茎秆上形成椭圆形或“眼 纹”状病斑。检查种子中有无附着病残体、土壤等。 7.2PCR凝胶电泳初筛检测 将7.1中的样品进行PCR初筛检测，PCR凝胶电泳检测见附录B。对于阳性结果进行下一步 检测。 7.3病原菌的分离培养 7.3.1培养基的制备 马铃薯蔗糖培养基（PSA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、玉米琼脂培养基（CMA）及选择性培养基 的制备见附录C。 7.3.2种子中病原菌的分离培养 取待检的进境病原菌的寄主种子样品50g放人250mL洁净的三角瓶中，加蒸馏水100mL，再加 表面活性剂吐温一201滴～2滴，用铝箔纸或培养纸将三角瓶封口，将三角瓶放在往复式振荡器上， 150g振荡洗涤5min。立即取下三角瓶，将洗涤悬浮液用干净纱布过滤后注入10mL～20mL刻度离 心管内，1000g离心3min，取出离心管，倾去上清液，再加剩余洗涤悬浮液，混合离心，直至所有洗涤 悬浮液离心完毕，留沉淀物。将沉淀物从离心管中全部移人2mL离心管中，12000g离心10min，以 移液管移取上清去除水分，在常温下将沉淀风干。对样品洗涤液中收集到的沉淀物在培养基上进行分 离培养。 7.3.3病残体中病原菌的分离培养 将变色的可疑材料，剪成约3mm~5mm小段，用0.5%次氯酸钠表面消毒10min，再用灭菌水冲 洗30min，置于玉米琼脂培养基（CMA）平板上（配方见附录C)，13℃～15℃，近紫外光照射培养，培养 7d～14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征。 7.3.4土壤中病原菌的分离培养 取2g土壤放入200mL灭菌水中，用磁力棒搅拌30min，使其充分混勾，悬浮液稀释10倍，取 养，培养7d～14d开始观察菌落形态和菌丝形态特征。 7.3.5分生孢子的诱导 7.3.2、7.3.3和7.3.4获得的菌丝，可通过以下方法获得分生孢子。水琼脂培养基（WA）上2周龄菌 2