ICS 65.020 DB35 B16 福 建 省 地 方 标 准 DB 35/T 1218—2011 马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程 Technical standard for identification on the physiological races of phytophthora infestans on potato 2011 - 12 - 31 发布 福建省质量技术监督局 2012 - 03 - 15 实施 发 布 DB35/T 1218—2011 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 接种体的制备 ...................................................................... 1 3.1 培养基的配制 .................................................................. 3.1.1 黑麦培养基 ................................................................ 3.1.2 选择性培养基 .............................................................. 3.1.3 MS 培养基.................................................................. 3.2 晚疫病样的采集 ................................................................ 3.3 晚疫病菌的分离 ................................................................ 3.3.1 保湿培养分离法 ............................................................ 3.3.2 薯片夹叶分离法 ............................................................ 3.4 晚疫病菌的鉴定与纯化 .......................................................... 3.5 晚疫病菌的保存 ................................................................ 3.6 孢子囊悬浮液的制备 ............................................................ 4 鉴别寄主的保存与扩繁 .............................................................. 3 4.1 4.2 5 保存 .......................................................................... 3 扩繁 .......................................................................... 3 接种鉴定 .......................................................................... 3 5.1 5.2 5.3 6 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 接种方法 ...................................................................... 3 接种技术 ...................................................................... 3 接种后的培养 .................................................................. 3 病情调查 .......................................................................... 3 6.1 6.2 调查时间 ...................................................................... 3 病情调查方法 .................................................................. 3 7 生理小种确定 ...................................................................... 3 8 鉴定后材料的灭活处理 .............................................................. 4 附录 A（资料性附录） 致病疫霉菌菌落培养特征及孢子囊形态特征 .......................... 5 附录 B（规范性附录） 植物水培标准营养液配方 .......................................... 6 附录 C（规范性附录） 马铃薯晚疫病菌生理小种命名方法 .................................. 7 I DB35/T 1218—2011 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则进行编写 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：李本金、陈庆河、翁启勇、兰成忠、赵健、邱荣洲。 II DB35/T 1218—2011 马铃薯晚疫病菌生理小种鉴定技术规程 1 范围 本规程规定了马铃薯晚疫病菌生理小种室内鉴定的接种体的准备、鉴别寄主的保存与扩繁、接种鉴 定、病情调查、生理小种确定、鉴定材料的灭活处理的方法。 本规程适用于马铃薯晚疫病菌生理小种的室内鉴定。 2 术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1 人工接种鉴定 Artifical inoculation 在人工控制的条件下，用马铃薯晚疫病菌孢子囊接种到马铃薯鉴别寄主的离体叶片上，根据接种叶 片的孢子囊产生状况确定菌株所属的具体生理小种。 2.2 接种体 Inoculant 用于人工接种鉴定用的马铃薯晚疫病菌( Phytophthora infestans )孢子囊悬浮液。 2.3 离体叶片接种法 Leaf inoculate in vitro 用鉴别寄主植株中部复叶的小叶片接种的方法。 2.4 对照品种 Contrast cultivar 不含已知抗病基因的马铃薯感病品种（r）。 2.5 鉴别寄主 Differentiate host 一套含有（R1～R11）主效抗性单基因和对照的马铃薯品种。 3 接种体的制备 1 DB35/T 1218—2011 3.1 培养基的配制 3.1.1 黑麦培养基 将黑麦50 g加适量去离子水浸泡36 h，匀浆机捣碎，55℃～60℃水浴1 h～2 h，四层纱布过滤，上 清液补水至1000 mL，加入琼脂17 g，121℃高压灭菌25min。 3.1.2 选择性培养基 -1 -1 -1 在黑麦培养基中加入利福平20mg．L ，氨卞青霉素200mg．L ，70%五氯硝基苯100mg．L 。 3.1.3 MS 培养基 硝酸铵(NH4NO3)1.65g，硝酸钾(KNO3)1.9g，氯化钙(CaCl2.2H2O)0.44g，硫酸镁(MgSO4.7H2O) 0.37g， 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17g，碘化钾(KI)0.83mg，硼酸（H3BO3）6.2 mg，硫酸锰(MnSO4.4H20)22.3 mg， 硫酸锌(ZnSO4.7H20)8.6 mg，钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)0.25 mg，硫酸铜(CuSO4.5H20)0.025 mg，氯化钴 (CoCl2.6H20)0.025 mg，硫酸铁(FeSO4.7H20)27.8 mg，乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)37.3 mg，肌 醇100.0 mg，烟酸0.5 mg，盐酸吡哆醇0.5 mg，盐酸硫胺素0.5 mg，甘氨酸2.0 mg，蔗糖30 g，琼脂7 g， 蒸馏水加至1000 mL，消毒前调至pH 5.8。 3.2 晚疫病样的采集 在晚疫病发生或流行时期，采集具有典型症状的马铃薯晚疫病病叶，用保鲜袋或薯片夹叶带回实验 室，贮放在18℃～20℃光照培养箱中备用。 3.3 晚疫病菌的分离 3.3.1 保湿培养分离法 将采回的病叶用自来水冲洗干净，凉干后，叶背朝上放入培养皿内，18℃～20℃培养箱内保湿培养 1d～2d。挑取霉层置于选择性培养基上，18℃～20℃培养7d～9d(菌落直径长至2cm～3cm)，备用。 3.3.2 薯片夹叶分离法 取无可见症状的感病品种薯块清洗干净，晾干，用75%的乙醇溶液浸泡30s～40s，取出，烧干表面 残存的乙醇。将薯块切成约5mm厚的薯片，放在已灭菌的培养皿中。取用薯片夹病叶法采集的一小块病 叶组织置于已消毒的两薯片之间，在18℃～20℃培养，待薯片长出霉层后，直接挑取霉层置于选择性培 养基上，18℃～20℃培养7d～9d(菌落直径长至2cm～3cm)，备用。 3.4 晚疫病菌的鉴定与纯化 挑取3.3分离的少量菌丝制成玻片，在100倍显微下观察菌体形态。当菌体形态与附录A相符时，则 确定所分离的病菌为致病疫霉菌。 挑取致病疫霉菌的菌落边缘的单菌丝段，置于选择性培养基上，按3.3.