ICS DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1729—2012 窖泥中脱氢酶活性的分析方法 Method of analysis for dehydrogenase activity of Pid Mud 文稿版次选择 2012 - 11 - 06 发布 安徽省质量技术监督局 2012 - 12 - 06 实施 发 布 DB34/T 1729—2012 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽古井贡酒股份有限公司提出并负责起草。 本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人：周庆伍、李安军、万春环、汤有宏、袁志强、刘国英、高江婧。 I DB34/T 1729—2012 窖泥中脱氢酶活性的分析方法 1 范围 本标准规定了窖泥中脱氢酶活性的分析方法。 本标准适用于浓香型白酒窖泥中脱氢酶活性的分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脱氢酶活性 dehydrogenase activity 在本方法规定的分析步骤条件下，每 1 g 绝干窖泥 l h 产生 1 μg 三苯基甲月替（TF）的量为一 个酶活力单位。 4 原理 利用无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride），接受氢后变 成红色的三苯基甲月替（TF，triphenyl formazan），根据产生红色进行比色定量分析，以判断脱氢酶 活性。根据红色的深浅，测出相应的吸光度（A值），求出脱氢酶活性。A值越大（红色深），脱氢酶活 性越高。TTC作为受氢体，其还原过程可用下式表示： 5 试剂 本标准所用水在未注明其他要求时，均指符合 GB/T 6682 中三级以上（包括三级）要求的水；本 标准中所用试剂，在未注明特殊要求时，均指分析纯（A.R）。 1 DB34/T 1729—2012 5.1 4 g/L TTC 溶液：准确称取 0.4 g（精确至 0.0001 g）TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）和 2 g （精确至 0.01 g）葡萄糖溶于少量蒸馏水中，再稀释到 100 mL 的容量瓶中贮存于棕色瓶中，一周更 换一次。 5.2 Tris-HCl 缓冲液（pH = 8.16）：准确称取 6.0370 g（精确至 0.0001 g）Tris（三羟甲基氨基 甲烷），再加入 20.0 mL 1.00 mol/L 的盐酸，再定容至 1000 mL。 5.3 0.36％ Na2SO3 溶液: 0.36 g（精确至 0.0001 g）亚硫酸钠定容到 100 mL 容量瓶中。 5.4 连二亚硫酸钠。 5.5 0.9％生理盐水。 5.6 丙酮。 5.7 甲醛。 6 仪器 6.1 6.2 6.3 6.4 7 分光光度计。 数显水浴锅。 分析天平（感量 0.0001 g）。 离心机（4000 rpm）。 分析步骤 7.1 绘制 TTC 标准曲线 7.1.1 配制系列浓度的 TTC 标准溶液 先取 5 支 50 mL 具塞比色管，按顺序尽快分别加入 0.36％Na2SO3 溶液（5.3）2.50 mL，Tris-HCl 缓冲液（5.2）7.50 mL，再分别吸取 4 g/L TTC 溶液（5.1）0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、 0.50 mL，放入5支比色管中，用蒸馏水定容至 50 mL，使成 8 μg/mL、16 μg/mL、24 μg/mL、32 μg/mL、 40 μg/mL系列浓度。同时另取一支 50 mL比色管，加入 0.36％ Na2SO3 溶液（5.3）2.50 mL，Tris-HCl 缓冲溶液（5.2）7.50 mL，加入蒸馏水至 50 mL，作为空白对照。 7.1.2 TTC 还原反应 取 6 支 10 mL 具塞比色管，分别吸取 5.00 mL 上述系列溶液（按浓度从小到大顺序依次吸取）， 向每支比色管中各加入 0.10 g 连二亚硫酸钠（5.4）粉末混匀，使 TTC 全部还原成红色的 TF。 7.1.3 测定吸光度 向上述各管加入 0.50 mL 甲醛终止反应，摇匀后加入 5.00 mL 丙酮振荡摇匀，37℃水浴 10 分钟； 4000 rpm 离心 5 分钟，吸取上清液 5.00 mL 在 485 nm 波长下测定吸光度A值，比色皿光程为 1 cm； 以 A 值为纵坐标，TTC 浓度为横坐标，绘制出 TTC 标准曲线。 7.2 窖泥脱氢酶活性的测定 7.2.1 2 窖泥悬浮液的制备 DB34/T 1729—2012 称取 10.0 g 鲜窖泥（其水分记作w，用百分数表示），放入 150 mL 三角瓶中，加 50 mL 0.9％ 生理盐水，用玻璃棒将窖泥打碎，倒入 100 mL 容量瓶中，再加 0.9％生理盐水定容至 100 mL，倒回 三角瓶中，半小时内振摇三次，使其充分摇匀。 7.2.2 TTC 还原反应 取若干 10 mL 具塞比色管，分别加入 0.36％ Na2SO3溶液（5.3）0.50 mL，Tris-HCL 缓冲液（5.2） 2.00 mL，窖泥悬浮液 2.00 mL（吸前摇匀），4 g/L TTC液（5.1）0.50 mL（对照管不加 TTC 液，以 0.50 mL 蒸馏水取代），盖紧塞子，将比色管摇匀；将摇匀后的比色管立即放入 37℃水浴中培养，至 显示红色为止。一般新培养窖泥需 16 h 至 24 h，老窖泥需 5 h 左右（以显色为准）。培养时每隔 1 h振荡摇匀，显色时间（h）记作t。 注：所有操作应当尽量在避光条件下进行。脱氢酶最适反应条件，温度 35℃～40℃，pH 值 7.4～8.5。 7.2.3 测定 向各管分别加入 0.50 mL 甲醛终止反应，摇匀后再向各管分别加入 5.00 mL 丙酮振荡摇匀，在 37 ℃水浴中保温 10 分钟；把各管分别倒入 50 mL 离心管中，4000 rpm 离心 5 分钟，吸取上清液 5.00 mL，在 485 nm 波长下测定吸光度 A 值，比色皿光程为 1 cm，并在标准曲线上查出相应的 TTC 浓度， 记作c（μg/mL）。 注：当吸光度 A 值大于 0.8 时，要适当稀释，使 A 值在 0.8 以下。 8 计算 脱氢酶活性 = 5c t × 10.0 × (1 - w) × 2 100 = 25c ....................... (1) t × (1 − w) 式中： c ——由标准曲线上查出的 TTC 浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； t ——显色时间，单位为小时（h）； w ——鲜窖泥的水分，单位用百分数表示（％）。 所得结果表示至一位小数。 9 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15％。 _________________________________ 3