ICS 11.020 B 41 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2081—2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光 PCR 方法 Method of fluorescence PCR for the detection of Yersinia pestis 2014 - 05 - 04 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 06 - 01 实施 发 布 DB22/T 2081—2014 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009、GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：王玮琳、刘阳、孙舒、聂丹丹、陈光宇、刘韬、刘金华、罗雁非、郑旭 I DB22/T 2081—2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR法 1 范围 本标准规定了鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR法。 本标准适用于鼠疫耶尔森菌的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3 警告 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按 GB 19489 中的有关规定执行。试样制备及核酸提取过程需在生物安全二级及以上实验室内进行。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR:聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）。 DNA:脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）。 Taq酶:DNA聚合酶。 FAM:6-羧基-荧光素（一种荧光报告基团）（6-Carboxy-fluorescein）。 TTAMRA（Carboxytetramethylrhodamine）。 TE:缓冲液 (Tris-Cl EDTA) 。 Tm值:核酸融解温度（Melting tempreture）。 Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数 (Cycle threshold) 。 5 原理 实时荧光PCR方法，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程， 最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧 光探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针 上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积 累荧光。TAMRA探针（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明），是罗丹明类荧光素衍生物， TAMRA易于被mercury arc lamps 的546nm光谱线所激发，且比荧光素具有更好的光稳定性和敏感性。 6 试剂与材料 1 DB22/T 2081—2014 6.1 所用水应符合 GB/T 6682 中的规定。 6.2 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3 引物及探针 上游引物 下游引物 探 针 5'- GTTAATACCAAATATATCCCTGA -3'， 5'- TCTGCGTCATAAAGCATTC -3'， FAM – TGCAGCCTCCACCGGGATGC - TAMRA 6.4 10% SDS 在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水 定容至1L，分装备用。 6.5 20mg/ml 蛋白酶 K 将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容 到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 6.6 CTAB/ NaCl 溶液 在80mL水中溶解4.1gNaCl，缓慢加入10g CTAB，同时加热并搅拌，如果需要，可加热至65℃使其溶 解，定容终体积至100mL。 6.7 10×TE 缓冲液(pH 8.0) 量取1mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 25mL,0.5mol/L EDTA(pH 8.0) 1mL ,置于100mL烧杯中。向烧杯中 加入约40mL的去离子水，混合均匀，定容至50 mL后，高压灭菌备用。 6.8 0.5mol/L EDTA 在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1 L，分装后高压灭菌备用。 7 仪器设备 7.1 荧光定量 PCR 系统。 7.2 生物安全柜。 7.3 高压灭菌锅。 7.4 高速台式冷冻离心机（10000r/m、生物安全型）。 7.5 组织匀浆仪（生物安全型 ） 。 7.6 涡旋混合器。 7.7 低温冰箱（-80℃）、冷藏冷冻冰箱（2℃～8℃和-20℃）。 7.8 微量移液器。 2 DB22/T 2081—2014 7.9 恒温水浴箱。 7.10 微量离心管：1.5mL。 8 试样制备 8.1 取 25mg～30mg 动物组织，放入 1.5mL 离心管中,加入 500μL TE 缓冲液, 用匀浆仪研碎。匀浆液 10000r/min, 离心 2min，弃上清，沉淀备用。 8.2 将菌液制备成悬浊液，10000r/min, 离心 2min，弃上清，沉淀备用。 9 检测步骤 9.1 DNA 提取 在上述样品沉淀中加入560μL TE缓冲液，反复吹打使之重悬，加入30μL的10% SDS和3μL蛋白酶K （20mg/mL），混匀，37℃孵育1h；加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μL CTAB/ NaCl溶液， 混匀，65℃温育10 min；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000 r/min 离心5 min，将上清转入一新 离心管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，10000 r/min 离心15min,去上清；75% 乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE缓冲液溶解DNA备用。 也可使用商业化的DNA提取试剂盒提取。 9.2 实时荧光 PCR 检测 反应体系总体积为25 μL，其中含： TaqMan Mix缓冲液 12.5 μL、上下引物（10 μmol/L）各1 μL、 探针（5 μmol/L）1 μL、模板DNA 5 μL、水4.5 μL。 第一阶段，95℃ 15min，1个循环；第二阶段，94℃ 10s，62℃ 45s，40个循环；荧光收集设置在 62℃ 45s时进行。 不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 9.3 对照标准 空白对照：以水代替DNA模板。 阴性对照：非目标菌的DNA作为荧光PCR反应的模板。 阳性对照：鼠疫耶尔森菌核酸 作为荧光PCR反应的模板。 10 结果判定及报告 10.1 PCR 有效性判断 空白对照：无TAMRA荧光信号，相应Ct值>40。 阴性对照：无TAMRA荧光信号，相应Ct值>40。 阳性对照：有TAMRA荧光信号，且TAMRA通道出现明显的扩增曲线，相应Ct值≤36。 否则判断为PCR无效。 10.2 结果分析条件设定 待测样品Ct值大于或等于40，内参照基因检测Ct值在20～35之间者，阴性对照、阳性对照和空白对 照结果正常者，则可判定该样品阴性。 3 DB22/T 2081—2014 待测样品Ct值小于40，内参照基因检测Ct值在20～35之间者，阴性对照、阳性对照和空白对照结果 正常者，则可判定该样品阳性。 待测样品Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴 性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品阳性；再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对 照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品阴性。 11 废弃物处理 检验过程中的废弃物按照有关规定进行无害化处理。 4