ICS 65.120 B 46 备案号：37938-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1819—2013 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 分光光度法 Determination of acidic protease activity in feed enzyme preparations Spectrophotometric method 2013 - 05- 15 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 09 - 01 实施 发 布 DB22/T 1819—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院。 本标准主要起草人：王伟、李媛媛、王莹、安伟、杨波。 I DB22/T 1819—2013 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的单位定义和测定分光光度法。 本标准适用于饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酸性蛋白酶活力单位 在40 ℃、pH 3.0条件下，酸性蛋白酶1 min水解酪素生成1 µg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力 单位U。 4 原理 酸性蛋白酶水解酪素产生酪氨酸，在碱性条件下含有酚基的酪氨酸将福林试剂还原生成钼蓝与钨 蓝。溶液的颜色与酶解产生的酪氨酸的量成正比，而酪氨酸的生成量与反应液中酸性蛋白酶的活力成正 比。用分光光度计测定其吸光度值，根据吸光度值计算酶制剂中酸性蛋白酶活力。 5 试剂及材料 标准中所有试剂，除另有规定外均为分析纯试剂，实验用水应符合GB/T 6682规定的三级以上用水 要求。 5.1 盐酸。 5.2 磷酸。 5.3 钨酸钠（Na2WO4·2H2O）。 5.4 钼酸钠（Na2MO4·2H2O）。 5.5 硫酸锂（Li2SO4）。 5.6 溴水。 5.7 无水碳酸钠。 1 DB22/T 1819—2013 5.8 三氯乙酸。 5.9 乳酸（80%～90%）。 5.10 乳酸钠（70%）。 5.11 酪素。 5.12 L-酪氨酸标准品（含量≥99.0%）CAS：60-18-4。 5.13 福林试剂 于2000 mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100 g、钼酸钠（Na2MO4·2H2O）25 g、水700 mL、 85%磷酸50 mL、盐酸100 mL，小火沸腾回流10 h，取下回流冷凝管，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4） 50 g、水50 mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15 min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，在 煮沸除去过量的溴），冷却转移至1000 mL容量瓶中，加水定容至刻度。混匀，过滤。制得的试剂应呈 金黄色，储存于棕色瓶中内。 5.14 福林工作溶液 取一份福林试剂与两份水混合，摇匀即为福林工作溶液。 5.15 碳酸钠溶液（0.4 mol/L） 称取无水碳酸钠42.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。 5.16 三氯乙酸溶液（0.4 mol/L） 称取无水三氯乙酸65.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。 5.17 盐酸溶液（0.1 mol/L） 量取盐酸9 mL，用水溶解并定容至1000 mL。 5.18 盐酸溶液（1 mol/L） 量取盐酸90 mL，用水溶解并定容至1000 mL。 5.19 乳酸缓冲（pH 3.0） 甲液 称取乳酸10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液 称取乳酸钠16 g，加水溶解并定容至1000 mL。 取甲液8 mL、乙液1 mL混合，加水9 mL稀释，摇匀即为pH 3.0的乳酸缓冲溶液。 5.20 酪素溶液（10 g/L） 称取酪素1.0g 置研钵中（精确至0.0001 g），加乳酸2～3滴湿润，研磨3 min，加入15 mL乳酸缓 冲溶液，静置，将上清液转移至100 mL容量瓶中。残渣继续研磨至少3 min，加入10 mL乳酸缓冲溶液， 静置，将上层清液转移至容量瓶中，如此反复至少3 次，将酪素全部转移至容量瓶中。在沸水浴中加热 至完全溶解，冷却后用乳酸缓冲液定容至刻度。该溶液在4 ℃贮存，有效期3 d。 5.21 L-酪氨酸标准贮备溶液 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1 g（精确至0.001 g），用1 mol/L 的盐酸溶液60 mL 溶解后定容至100 mL容量瓶中，即为1 mg/mL酪氨酸标准贮备溶液，该溶液在4 ℃贮存，有效期3 d。 5.22 L-酪氨酸标准溶液 准确量取1 mg/mL酪氨酸标准贮备溶液10.0 mL置100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸定容至刻度， 即得到100 μg/mL L-酪氨酸标准溶液，该溶液现用现配。 6 仪器 6.1 6.2 6.3 6.4 2 紫外-可见分光光度计。 分析天平：感量 0.0001 g。 酸度计：精确至 0.01。 电加热器。 DB22/T 1819—2013 6.5 6.6 6.7 6.8 7 研钵。 恒温水浴摇床：温控范围 30℃～60℃，精度±0.2℃。 比色管：25 mL。 秒表。 分析步骤 7.1 样品制备 称取适量试样（精确至0.001 g）置研钵中，用少量乳酸缓冲液（5.19）润湿，研磨至少3 min，加 入15 mL乳酸缓冲液（5.19）混匀，静置，将上层清液转移至100 mL容量瓶中。沉渣部分继续重复上述 操作至少3次，将试样全部转移入容量瓶中，用乳酸缓冲液（5.19）定容至刻度，摇匀。根据酶活力用 乳酸缓冲液（5.19）稀释至适当浓度，供测试样（酶活力应控制在8 U/mL~10 U/mL范围内）。 7.2 样品测定 7.2.1 样品空白测定溶液 准确量取上述测定溶液（混悬溶液，摇匀后立即量取）1.0 mL于25 mL 比色管中，置温度40℃±0.2 ℃、振摇速度100次/min的水浴摇床中预热2 min，加入2.0 mL三氯乙酸溶液（5.16），摇匀，再置水浴 摇床中保温10 min（准确计时）。 取1.0 mL 酪素溶液（5.20）加入上述比色管中，摇匀，静置10 min，用定量滤纸过滤，滤液备用。 准确量取滤液1.0 mL置于另一比色管中，加5.0 mL碳酸钠溶液（5.15），加1.0 mL福林工作溶液 （5.14），置温度40℃±0.2℃的水浴摇床中显色20 min（准确计时），作为样品空白测试溶液。 7.2.2 样品测定溶液 准确量取上述测定溶液（混悬溶液，摇匀后立即量取）1.0 mL于25 mL 比色管中，置温度40℃ ±0.2℃、振摇速度100次/min的水浴摇床中预热2 min，加1.0 mL酪素溶液（5.20），摇匀，再置 水浴摇床中保温10 min（准确计时）。 取2.0 mL三氯乙酸溶液（5.16）加入上述比色管中，摇匀，静置10 min，用定量滤纸过滤，滤液备 用。 准确量取滤液1.0 mL置于另一比色管中，加5.0 mL碳酸钠溶液（5.15），加1.0 mL福林工作溶液 （5.14），置温度40℃±0.2℃的水浴摇床中显色20 min（准确计时），作为样品测试溶液。 7.2.3 绘制 L-酪氨基酸标准曲线 准确量取L-酪氨酸标准溶液（5.21）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于6只10 mL容量瓶 中，加水定容至10 mL，即浓度为0、10、20、30、40、50μg/mL的标准工作溶液。分别取L-酪氨酸标准 工作溶液1.0 mL置于另外6只25 mL 比色管中，各加5.0 mL碳酸钠溶液（5.15）和1.0 mL福林工作溶液 （5.14）mL，置40℃±0.2℃水浴摇床中显色20 min（准确计时），作为标准测试溶液。以0浓度标准测 试溶液为参比，在680 nm 波长处分别测定其吸光度。以吸光度A为横坐标，酪氨酸的浓度C为纵坐标， 计算出标准曲线回归方程。 7.2.4 测定 以0浓度标准测试溶液为参比，在680 nm波长处测定样品空白测试溶液和样品测试溶液的吸光度， 用标准曲线回归方程计算出对应的L-酪氨酸量，该溶液能够保持稳定至少2 h。 3 DB22/T 1819—2013 7.3 结果计算与表述 7.3.1 结果计算 酸性蛋白酶活力按（1）式计算： X = w´ n ....................................... (1) 10 ´ m 式中： X ——酶活力单位，U/g; w ——用回归方程计算出的试样溶液相当的 L-酪氨酸量，μg； n ——试样溶液总稀释倍数； 10 ——酶反应时间，min； m——试样质量，g。 8 精密度 两平行测定结果的允许相对偏差不大于3.0%。 _________________________________ 4