ICS 65.020.30 B 43 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2394—2015 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的 制备和鉴定 Regulation of preparation and identification of induced pluripotent stem cells from pigs 2015 - 12 - 15 发布 吉林省质量技术监督局 2016 - 01 - 25 实施 发 布 DB22/T 2394—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由吉林省标准研究院提出。 本标准由吉林省畜牧业管理局归口。 本标准起草单位：吉林省标准研究院。 本标准主要起草人：赵慧明、张学明、李子义、唐博、崔娜娜、王琪、杨磊。 I DB22/T 2394—2015 猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的制备和鉴定 1 范围 本标准规定了源于猪胎儿成纤维细胞的猪诱导多潜能干细胞（iPSCs）的工作区条件、主要仪器设 备、清洗与消毒、试剂及液体配制、猪iPSCs的制备、警示、标签及其他要求。 本标准适用于猪iPSCs在畜牧业生产实践、基础医学研究和临床医疗等方面的应用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 15562.2 环境保护图形标志 固体废物贮存（处置）场 GB/T 24863 畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程 HG/T 3935 哺乳类动物细胞培养基 NY/T 1900 畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 SN/T 2330 化妆品胚胎和发育毒性的小鼠胚胎干细胞试验 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 诱导多潜能干细胞 induced pluripotent stem cells (iPSCs) 通过转染特定的转录因子（如经典的胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4组合），从已 分化体细胞（如成纤维细胞）重编程而获得的多潜能干细胞。 3.2 猪胎儿成纤维细胞 porcine fetal fibroblast (PFF) 从妊娠25-30天猪胎儿中，去头、尾、四肢、骨骼、内脏后，消化分离获得的有良好增殖能力的细 胞。 3.3 饲养层细胞 feeder layer cell 将动物胎儿成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，失去分裂增殖能力的活细胞。 3.4 拟胚体 embryoid body 釆用悬滴法培养，将干细胞或iPSCs克隆消化成单细胞，检测其体外发育分化能力的方法。 3.5 畸胎瘤 teratoma 1 DB22/T 2394—2015 采用皮下注射法，将干细胞或iPSCs注射到免疫缺陷鼠皮下组织中，在SPF级条件下饲养，被注射细 胞在体内形成的含三胚层组织结构的瘤体组织。 4 工作区条件 4.1 工作区域一般由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室、SPF 实验动物饲养设施等组成，内部设 备条件按照 GB/T 24863 和 SN/T 2330 执行。 2 3 4.2 缓冲间应不小于 3 m ，并设有更衣柜和紫外灯；紫外灯的强度≥1.5 W/m ，紫外灯管距地面不应超 过 2.5 m，每次照射时间 30 min 以上。 4.3 无菌室的最低标准应达到万级，并配备通风设备。 5 主要仪器、设备 超净工作台、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、离心机、CO2培养箱、纯水装置、高压蒸汽灭菌 器、电子天平、倒置显微镜、荧光显微镜、PCR仪、荧光定量PCR仪、-80℃超低温冰箱。 6 清洗与消毒 所用玻璃器皿和金属器材的清洗与消毒按照GB/T 24863执行。 7 试剂及液体配制 各种使用液均用去离子水配制，充分溶解，立即用0.22 μm滤膜滤过除菌，除特殊说明，均分装贮 存于-20℃下备用，并执行GB/T 24863和NY/T 1900。包括：水、DMEM (dulbecco's modified eagle medium) 培养基、青-链霉素、无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶-EDTA、冻存液、丝裂霉素C、LB培养基、 293细胞培养基、转染培养基、Opti-MEM、ES培养基、条件性培养液、IV型胶原酶（见附录A.1～A.14）。 8 猪 iPSCs 的制备 8.1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备 将见栓12.5 d的SPF级（无特定病原体）ICR品系孕鼠用脱颈法处死，分离、培养胎儿成纤维细胞， 原代细胞生长至约90%密度时进行传代、丝裂霉素C处理、清洗、消化、计数、冻存。（具体步骤见附录 A.15）。 8.2 8.2.1 猪胎儿成纤维细胞制备 取材 无菌手术取出妊娠25 d～30 d的猪子宫，两端扎紧后运回实验室，将子宫整个浸泡于75%的酒精中 消毒30 s，将消毒后的子宫送入细胞培养室中，剪开子宫，取出羊膜完整的胎儿置于75%的酒精中浸泡 30 s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀将胎儿去除头、尾、四肢、内脏、脊椎骨及肋 骨，用PBS冲洗剩余组织，将组织剪碎至组织块直径均小于1 mm。 8.2.2 2 消化 DB22/T 2394—2015 加入少量PBS，将组织块吸出置于50 ml离心管中，加入10 ml 0.25%胰酶-EDTA溶液，置于37℃培养 箱中消化15 min，间隔2 min～3 min吹打一次。消化结束后加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终 止消化，轻轻吹打将细胞重悬，使用200目筛网过滤，收集滤液，300 g离心8 min，弃净上清液。 8.2.3 培养 加入10 ml 含10% FBS的DMEM将细胞重悬，移入2个T-75培养瓶中，每瓶再加入10 ml培养液，置于 培养箱中，37.5℃、5%CO2条件培养培养，24 h后换液，去除悬浮的细胞。待细胞铺满培养瓶面积的80%～ 90%（2 d～3 d），可将细胞进行冻存或传代。 8.3 诱导 iPSCs 质粒制备 8.3.1 转化 将包含4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4，参见附录）和绿色荧光蛋白（GFP)的逆转录病 毒质粒（pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc和pMX-GFP )及辅助质粒Vsvg分别转入DH5α感受 态细菌（见附录A.16）。 8.3.2 筛选 向每管细菌中加入液体LB培养基900 μl，置于恒温摇床中37℃下120 rpm震荡45 min；从每管中吸 取100 μl液体，均匀滴于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，使用涂菌棒涂匀后，置于37℃生化培养箱 中培养12 h。出现明显菌落后，使用小枪头挑取菌落置于5 ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 ℃、200 rpm震荡12 h。 8.3.3 质粒提取和浓缩 将上述菌液加入到200 ml新鲜含氨苄青霉素液体LB培养基中，37℃下200 rpm震荡12 h，用OMEGA 无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒；测提取质粒的浓度，用冰乙醇沉淀法（见附录A.17）浓缩质粒，使 质粒浓缩达到1 μg/μl以上，标记后置于-20℃冰箱保存备用。 8.4 逆转录病毒制备 8.4.1 293 细胞培养 用T-75培养瓶和293细胞培养基，在37.5℃、5%CO2条件下培养293GT细胞，培养第2 d，待细胞生长 至60%～70%密度时吸出旧培养液，加入10 ml转染培养基置于培养箱中备用。 8.4.2 转染 将pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc、pMX-GFP和Vsvg质粒各10 μg加入1 ml Opti-MEM 中混匀；将50μl Lipofectamine 2000转染试剂加入1 ml Opti-MEM中混匀，室温孵育5min；将上述两种 溶液混匀并室温孵育20 min。将上述溶液加入293GP细胞中晃匀后，置于培养箱中，37.5℃、5%CO2条件 培养，每2 h晃动一次培养瓶，培养6 h后吸去培养液，换为12 ml新鲜293细胞培养液培养。 8.4.3 逆转录病毒液收集 培养第4天，收集293GT细胞培养液，使用0.45 μm滤器过滤，标记好后置于4℃冰箱保存；再向 293GT细胞中加入12 ml 293细胞培养基继续培养，第5天再次收集细胞培养液，使用0.45 μm滤器过滤后 与第4天收集的上清混匀后置于4℃冰箱保存备用。 3 DB22/T 2394—2015 8.5 猪 iPSCs 的诱导 猪 iPSCs 的诱导过程如下： a) D0 将 3 代以内猪胎儿成纤维细胞培养至 90%汇合时，使用 0.25%胰酶-EDTA 消化，制备成单 6 细胞悬液，以每孔 2×l0 个的密度接种到 6 孔板上培养，此时记为零天（D0，以此类推）。 b) D1 待细胞长至 80%-90%汇合，每孔换 2 ml 新鲜培养液，同时每孔加入 5 种病毒液（Oct4、 Klf4、Sox2、C-myc、GFP )，每种病毒各 2 ml，置于培养箱中 37.5℃、5%CO2 条件培养。 c) D2 弃去培养液，每孔中加入 2 ml 新鲜培养液，同时每孔再加入 5 种病毒液（同前），每种 病毒各 2 ml，置于培养箱中 37.5℃、5%CO2 条件培养。 d) D3 弃去培养液，每孔加入 2 ml 新鲜 ES 培养基按照 SN/T 2330、HG/T 3935 执行，置于 培养箱中 37.5℃、5%CO2 条件培养。 e) D4 复苏饲养层细胞，于 100 mm 培养皿中培养。 f) D5 将感染后的细胞用 0.25%胰酶 EDTA 消化，传至铺有饲养层的 100 mm 培养皿中，加入 9 ml ES 培养液于 37.5℃、5%CO2 条件下培养。此后每天换一次培养液，于 D10 后换为条件性培养液培养。每 日观察细胞变化，直至出现 ES 形态的细胞克隆。 8.6 猪 iPSCs 的收集与传代培养 在体视显微镜下挑取形态较好，边界清晰的原代iPSCs克隆，使用玻璃针（制作见附录A.18）将其 边缘与饲养层细胞分开，从一端轻轻地将克隆推起，将克隆吸出，轻轻吹打使其分散成若干较小的克 隆，置于铺有饲养层的六孔板中扩大培养。 8.7 猪 iPSCs 的鉴定 8.7.1 碱性磷酸酶染色 用碱性磷酸酶染液对所获细胞克隆进行染色，阳性克隆呈紫红色或红色（见附录A.19）。 8.7.2 免疫荧光染色分析 8.7.2.1 一抗孵育 克隆细胞经洗涤、固定、透