ICS 65.020.20 B31 备案号： 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1106—2015 萝卜抗黑腐病种质鉴定技术规程 Rules for evaluation of radish germplasm for resistance to black rot （报批稿） 2015 - 10 - 30 发布 湖北省质量技术监督局 2015 - 12 - 18 实施 发 布 DB42/T 1106—2015 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语与定义 ........................................................................ 1 4 接种体制备 ........................................................................ 2 5 室内抗性鉴定技术 .................................................................. 2 6 田间接种鉴定 ...................................................................... 3 7 病情调查 .......................................................................... 3 8 抗性评价标准 ...................................................................... 4 附录 A（资料性附录） 萝卜黑腐病病原菌 ................................................ 5 I DB42/T 1106—2015 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由湖北省农业科学院提出。 本标准由湖北省农业科学院归口管理。 本标准起草单位：湖北省农业科学院经济作物研究所。 本标准主要起草人：甘彩霞、袁伟玲、邓晓辉、崔磊、王晴芳。 II DB42/T 1106—2015 萝卜抗黑腐病种质鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了萝卜（Raphanus sativus L.）抗黑腐病（Xanthomonas campestris pv. Campestris (Pammel) Dowson）抗性种质鉴定技术中的术语与定义、接种体制备、室内抗性鉴定技术、田间接种鉴定、病情 调查及抗性评价标准。 本标准适用于湖北地区萝卜抗黑腐病抗性的室内鉴定及评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1857.6-2010 黄瓜主要病害抗病性鉴定技术规程 第 6 部分：黄瓜抗细菌性角斑病鉴定技术规 程 NY/T 1858.4-2010 番茄主要病害抗病性鉴定技术规程 第 4 部分：番茄抗青枯病鉴定技术规程 NY/T 2060.2-2011 辣椒抗病性鉴定技术规程 第 2 部分：辣椒抗青枯病鉴定技术规程 3 术语与定义 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 下列术语和定义适用于本文件。 抗病性 disease resistance 植物体所具有的能够减轻或克服病原物致病作用的可遗传特性。 抗病性鉴定 identification of disease resistance 通过适宜技术方法鉴定植物对特定病害的抵抗水平。 抗性评价 evaluation of resistance levels 根据采用的技术标准判别植物对特定病害反应程度和抵抗水平的描述。 致病性 pathogenicity 病原物所具有的破坏寄主和引起病变的能力。 人工接种 artificial inoculation 在适宜条件下，通过人工操作将接种体置于植物体适当部位并使之发病的过程。 病情级别 disease rating scale 人为定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。 病原物分离 pathogenic isolation 1 DB42/T 1106—2015 3.8 3.9 3.10 3.11 采用人工方法从植物发病部位分离获得的在特定环境条件下培养的病原物。 培养基 culture medium 可以使病原物生长的自然或人工配制的基质。 接种体 inoculum 用于接种以引起病害的病原物或病原物的一部分。 接种悬浮液 inoculum suspension 用于接种的含有定量接种体的液体。 病情指数 disease index(DI) 通过对植物个体发病程度（病情级别）数值的计算所获得的群体发病程度的数值化描述形式。 4 接种体制备 4.1 病原物分离 从黑腐病侵染发病形成典型“V”字形病斑的植株上采集分离病原物(2012年采集于湖北省武汉市武 湖地区)，采用稀释平板涂布法，挑取单菌落保存，并按柯赫氏法则进行验证，得到纯培养，放入4℃冰 箱中保存备用。 采用Biolog系统与16S rDNA序列分析,结果一致,相互得到了验证。确定获得油菜黄单胞杆菌油菜致 病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson）菌株，保存备用。 4.2 接种体繁殖 将黑腐病菌种接种前用NYGB(蛋白胨5.0g,酵母粉3.0g,甘油20.0g，1000ml) 液体培养基进行培养， 200r/min，24h，28℃。萝卜黑腐病接种浓度OD600=0.1(108cfu ml-1)。 4.3 菌种保存 甘油斜面保存法：将NYGA(蛋白胨5.0g,酵母粉3.0g,甘油20.0g，琼脂17g,1000ml)固体培养基做成试 管斜面,挑取病原菌菌落划线，生长出菌落后三天可加入30%-50%甘油或者纯甘油保存，保存于-20℃冰 柜可存活2年~3年，温度越低存活期越长，超低温冰箱可存活3年~5年。 5 室内抗性鉴定技术 5.1 鉴定室设置 人工接种鉴定室应具备人工调节温度、湿度及光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境。 5.2 鉴定对照 鉴定时设“雪单一号”萝卜为抗病对照品种，耐热板叶萝卜“短叶13”为感病对照品种。每接种材 料设置清水接种为对照。 5.3 鉴定设计 鉴定材料随机或顺序排列，每份材料重复3次，每重复10株苗。 5.4 鉴定材料育苗 鉴定材料种子经5%次氯酸钠溶液浸种10min后，用清水冲洗，放入垫有两层滤纸的培养皿中，然后 于恒温培养箱中28℃催芽。待胚根长至0.5cm时，将其播于装有基质的育苗盘中，育苗基质为草炭、有 机肥和菜田土（2:1:1），基质经高温蒸汽灭菌（120℃，30min）。在25℃～30℃的日光温室内育苗， 幼苗应生长健壮、一致。 5.5 接种方法 5.5.1 接种时期 2 DB42/T 1106—2015 萝卜黑腐病抗性鉴定接种期为5叶期～6叶期。 5.5.2 接种浓度 7 8 5.0×10 cfu/mL～1.0×10 cfu/mL。 5.5.3 接种方法 采用喷雾方法进行。用小型喷雾器（工农-16型电动喷雾器）将接种物喷洒到植株上至叶片正反两 面湿润而不下滴，设置清水接种为对照，接种后保湿24 h，湿度保持在90%～95%。 6 田间接种鉴定 长江中下游地区于春季4月上中旬播种，5月上中旬选择雨后湿度较大的晴天接种，接种后搭小拱棚 进行保湿24 h，设置清水接种为对照。 7 病情调查 7.1 调查时间 接种后7d调查病情。 7.2 病情分级 室内病情分级及其对应的症状描述见表1。 表1 萝卜黑腐病病情级别划分 病情级别 症状描述 0 无症状 0.5 叶上有一个小斑 1 叶上有几个病斑或一个较大的病斑 3 叶上发病区小于叶面积的10% 5 叶上发病区占叶面积的11%～25% 7 叶上发病区占叶面积的26%～50% 9 叶上发病区大于叶面积的51% 7.3 病情指数调查方法 调查每份鉴定材料接种叶发病情况，根据病害症状描述，逐份材料整株每片叶进行调查，记载病情 级别，计算出病情指数(DI)。 病情指数按公式（1）计算： ∑(s×n) DI= ×100…………………..(1) N×S 式中： DI 病情指数； s 各病情级别代表数值； n 各病情级别病株（叶）数； N 调查总株（叶）数； S 最高病情级别代表值。 3 DB42/T 1106—2015 8 抗性评价标准 依据鉴定材料的发病程度（病情指数）确定其对萝卜黑腐病的抗性水平，划分标准见表2。 表2 萝卜黑腐病抗性评价标准 病情指数 抗性评价 0 免疫（I） 0＜DI≤10 高抗（HR） 10＜DI≤20 抗病（R） 20＜DI≤40 中抗（MR） 40＜DI≤60 感病（S） DI＞60 高感（HS） 4 DB42/T 1106—2015 AA 附 录 A （资料性附录） 萝卜黑腐病病原菌 A.1 学名 油菜黄单胞杆菌油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson）。 A.2 形态描述 病原细菌短杆状，（0.4～0.5）×（0.7～3.0）μL，单根鞭毛，极生，有荚膜，无芽孢。革兰氏染 色阴性反应，好气性。在牛肉膏琼脂培养基上菌落呈圆形，初呈淡黄色，后呈蜡黄色，表面有光泽，但 不粘滑。在马铃薯培养基上，菌落呈深厚的黄色粘稠状。 A.3 为害部位及症状 可危害萝卜叶和根。该病多从叶缘向内扩展，形成典型的“V”字形黄褐色枯斑，叶脉变黑，叶 缘变黄，后扩及全叶；根部受侵染时，病原菌沿髓部维管束侵染，萝卜中部腐烂变黑形成中空，雨过天 晴后，易干枯掉根部染病后，导管变黑，内部组织干腐，外观往往看不出明显症状，但髓部多成黑色干 腐状，后