ICS 65.020 B 04 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3802—2019 花生品种鉴定技术规程 SSR 标记法 Protocol for identifying peanut variety—SSR marker method 2019 - 12 - 24 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 01 - 24 实施 发 布 DB37/T 3802—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省花生研究所。 本标准主要起草人：闫彩霞、单世华、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。 I DB37/T 3802—2019 花生品种鉴定技术规程 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）标记法进行花生（ Arachis hypogaea L.）品种鉴定的术语与定义、仪器设备、试剂与溶液配制、引物信息、鉴定方法、数据读取 与判定方法。 本标准适用于花生品种的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 NY/T 2237 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 花生 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 简单重复序列 simple sequence repeat，SSR 由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联 重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。 3.2 推荐引物 recommended primer 根据最少引物区分最多品种的原则筛选出的一套SSR引物，具有条带清晰、多态性高、重复性好、 均匀分布的特点，用于DNA分子数据的采集和品种鉴定。 3.3 参照品种 reference variety 具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异扩增片段的大小， 校正仪器设备的系统误差。 4 仪器设备 1 DB37/T 3802—2019 所用仪器设备见附录A。 5 试剂、溶液配制及引物信息 5.1 试剂及溶液配制 试剂及溶液配制见附录B（除特殊说明外，所用试剂均为分析纯）。 5.2 引物信息 推荐引物的相关信息见附录C。 6 鉴定方法 6.1 样品准备 6.1.1 样品为花生种子及其他植物组织。种子样品的分样和保存，按照 GB/T 3543.2 的规定执行。 6.1.2 每份样品中至少随机抽取 10 个个体，每个个体单独分析。如样品为种子，水培法种植，至第三 片真叶长出后备用。参照品种（见附录 D）各种植 2 粒，混合分析。 6.2 样品的 DNA 提取 6.2.1 DNA 提取 取花生幼嫩组织50 mg，放入组织破碎仪中，液氮研磨。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基 因组DNA，室温风干，加入100 μL 1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5 μL RNAase， 37 ℃温育1 h，－20 ℃下保存留用。 6.2.2 DNA 浓度和质量检测 利用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Gold View染料进行染色。测定DNA溶液的OD260/OD280值， 在1.8～2.0范围内最佳。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算DNA的浓度。 稀释至工作浓度为30 ng/μL，置于4 ℃下备用。 6.3 PCR 扩增 6.3.1 参照品种的使用 在进行PCR扩增和等位基因检测时，不同SSR引物的参照品种参见附录C。 6.3.2 反应体系 总体系为10 μL，包括4.5 ng/μL DNA，0.8 μmol/L F/R引物，1×Dream Taq Green PCR Master Mix，1.9 μL蒸馏水，混匀。 6.3.3 反应程序 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，进行35个循环；72 ℃延伸 5 min；4 ℃下保存备用。 6.4 PCR 产物检测 2 DB37/T 3802—2019 6.4.1 玻璃板组装 清洗玻璃板和样品梳，晾干。用无水乙醇擦拭凹板和平板各2遍，待玻璃板彻底干燥后，将1.0 mm 厚的塑料边条整齐摆放在平板两侧，盖上凹板，对齐，夹紧，用水平仪调平。 6.4.2 制胶 根据凝胶的面积和数量，调整6%聚丙烯酰胺凝胶溶液的用量，分别加入1 ‰的APS和1 ‰的TEMED， 轻轻摇匀，防止产生气泡，迅速灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，在上部凹面处轻轻插入样品梳平端，深 度约0.8 cm。室温下静置1 h，使胶液聚合，如室温较低可适当延长聚合时间。 6.4.3 电泳准备 将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，至下槽液面约为槽 高的1/3，上槽液面高于玻璃板凹面约1 cm。拔去梳子，冲洗胶孔，清除底层气泡和杂质。将样品梳齿 端插入凝胶1 mm～2 mm处。 6.4.4 上样 PCR产物中加入1/6体积的6×loading buffer，微量移液器上样，每孔加入2 μL PCR扩增产物（上 样量可根据加样孔的大小适当调整）。20 bp DNA Ladder分子量标记加入两侧加样孔中，对应参照品种 的PCR产物加入中间加样孔中，检测样品PCR产物加入其余加样孔中。 6.4.5 电泳 电压为200 V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示带到达胶板底部，停止电泳， 电泳时间一般为2 h。 6.5 银染显色 6.5.1 水洗 电泳结束后，分开两块玻璃板，取出凝胶，用蒸馏水快速漂洗2次，不超过10 s。 6.5.2 银染 将凝胶转移至适量染色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇10 min。 6.5.3 水洗 将凝胶从染色液中取出，在蒸馏水中快速漂洗2次，时长8 s～10 s。 6.5.4 显影 将凝胶转移至适量显色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇至带纹清晰。 6.5.5 漂洗 将凝胶转移到蒸馏水中清洗，直至蒸馏水澄清。 6.6 成像 将凝胶置于凝胶成像系统的工作台上，选用透射紫外光观察，调节至图像最清晰，保存。 3 DB37/T 3802—2019 7 数据读取与判定方法 7.1 数据读取 利用凝胶分析软件Quantity one读取条带，每个SSR位点的等位变异大小用扩增片段长度表示，单 位为bp。与对应的参照品种进行比较，校正系统误差，确定送检样品在每个位点的等位变异大小，获得 送检样品27个SSR位点的指纹图谱。 7.2 判定方法 根据送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数，对送检样品进行鉴定。 ——当送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数≥2，则判定为“不同品种”； ——当差异位点数=1，判定为“近似品种”； ——当差异位点数=0，判定为“疑同品种”。 对于差异位点数≤1个的送检样品，应按GB/T 19557.1给出的原则和NY/T 2237给出的方法进行田间 测试，确定送检样品在表型性状上是否与对应品种一致。 4 DB37/T 3802—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 仪器设备 A.1 组织破碎仪 温控范围为－40 ℃～室温。 A.2 高压灭菌锅 灭菌温度为105 ℃～136 ℃，最大工作压力为0.22 MPa。 A.3 凝胶成像系统 分辨率不低于400百万像素。 A.4 高速冷冻离心机 最大离心力不小于15 000 g。 A.5 PCR扩增仪 控温范围为0 ℃～100 ℃。 A.6 紫外可见分光光度计 波长范围为190 nm～1 100 nm。 A.7 恒温水浴锅 温度范围为室温～99 ℃。 A.8 水平摇床 转速为0 rpm～230 rpm。 A.9 微波炉 最高耐温120 ℃。 A.10 电子天平 5 DB37/T 3802—2019 精确到0.01 g。 A.11 电泳槽 样品通量为1.0 mm厚。 A.12 磁力搅拌器 转速为0 r/min～2 500 r/min，控温范围为室温～100 ℃。 A.13 酸度计 测量范围为0.00 pH～14.00 pH。 A.14 微量移液器 量程分别为2 µL、10 µL、100 µL、200 µL、500 µL和1 000 µL。 6 DB37/T 3802—2019 BB 附 录 B （规范性附录） 试剂及溶液配制 B.1 试剂 B.1.1 B.1.2 B.1.3 B.1.4 B.1.5 B.1.6 B.1.7 B.1.8 B.1.9 B.1.10 B.1.11 B.1.12 B.1.13 B.1.14 B.1.15 B.1.16 B.1.17 B.1.18 B.1.19 B.1.20 B.1.21 B.1.22 B.1.23 B.1.24 乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2） 。 三羟基甲基氨基甲烷（Tris） 。 盐酸（HCl，36 %） 。 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 。 氯化钠（NaCl） 。 硼酸（Borate） 。 丙烯酰胺。 甲叉双丙烯酰胺。 四甲基乙二胺（TEMED） 。 无水乙醇。 过硫酸铵（APS） 。 硝酸银（AgNO3） 。 琼脂糖。 6×loading buffer。 Gold View染料。 RNAase（10 mg/mL） 。 酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1） 。 异丙醇。 四硼酸钠。 甲醛。 2×Dream Taq Green PCR Master Mix。 SSR引物（10 μmol/L） 。 20 bp DNA Ladder。 重蒸水或符合GB/T 6682规定的一级水. B.2 溶液配制 B.2.1 1mol/L NaOH 4 g NaOH，加蒸馏水定容至100 mL。 B.2.2 1mol/L Tris-Cl（pH8.0）溶液 称取121.1 g Tris，加蒸馏水定容至1 L，浓盐酸调至pH8.0，高压灭菌备用。 B.2.3 0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶液 7 DB37/T 3802—2019 称取186.1 g EDTA-Na2，800 mL蒸馏水，加热定容至1 L，1 mol/L NaOH调至pH8.0，高压灭菌备用。 B.2.4 1×