ICS65.020.30 CCSB50 中华人民共和国国家标准 GB/T47226—2026 代替GB/T15805.6—2008 杀鲑气单胞菌病诊断方法 DiagnosticmethodsfortheAeromonassalmonicidadisease 2026-02-27发布 2026-09-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T15805.6—2008《鱼类检疫方法 第6部分:杀鲑气单胞菌》,与GB/T15805.6— 2008相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: ———更改了试剂和材料(见第5章,GB/T15805.6—2008的第3章); ———更改了仪器设备(见第6章,GB/T15805.6—2008的第4章); ———增加了临床症状(见第7章); ———更改了取样(见第8章,GB/T15805.6—2008的5.1); ———更改了细菌分离(见第9章,GB/T15805.6—2008的5.2); ———更改了生理生化鉴定(见第10章,GB/T15805.6—2008的5.3); ———增加了PCR检测方法(见第11章); ———增加了实时荧光PCR检测方法(见第12章); ———更改了综合判定(见第13章,GB/T15805.6—2008的第6章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本文件起草单位:深圳海关动植物检验检疫技术中心、全国水产技术推广总站、成都海关技术中心。 本文件主要起草人:刘荭、安微、吴江、张翔、蔡晨旭、冯东岳、薛霖朗、徐皓月、孙洁、王津津、廖立珊、 郑晶。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———1995年首次发布为GB/T15805.1—1995,2008年第一次修订为GB/T15805.6—2008; ———本次为第二次修订,标准编号调整为GB/T47226—2026。 ⅠGB/T47226—2026 杀鲑气单胞菌病诊断方法 1 范围 本文件描述了杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)病诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、 样品、细菌分离、生理生化鉴定、PCR检测、实时荧光PCR检测和综合判定的方法。 本文件适用于鱼类杀鲑气单胞菌病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088 出入境动物检疫采样 SC/T7011.1 水生动物疾病术语与命名规则 第1部分:水生动物疾病术语 SC/T7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 SC/T7011.1界定的术语和定义适用于本文件。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ1:黑洞淬灭剂1(blackholequencher1) bp:碱基对(basepair) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) Ct值:阈值循环数,即荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cyclethresholdvalue) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM:6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein) GFM:葡萄糖发酵培养基(glucosefermentationmedium) O/129:2,4-二氨基-6,7-二异丙基喋啶(2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) TAE缓冲液:由三羟甲基氨基甲烷(trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的 缓冲液 Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TSA:胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar) 1GB/T47226—2026 TSB:胰蛋白胨大豆肉汤(trypticasesoybroth) Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) vapA基因:毒力阵列蛋白A基因(virulencearrayproteinAgene) 5 试剂和材料 本文件中所有化学试剂,除非另有规定,仅使用分析纯试剂;水为符合GB/T6682中规定的一 级水。 5.1 杀鲑气单胞菌参考菌株:由动物病原微生物菌(毒)种保藏国家行政主管部门指定机构提供。 5.2 革兰氏染色液试剂:按说明书指示的方法使用。 5.3 氧化酶试纸:按说明书指示的方法使用。 5.4 过氧化氢溶液(3%):4℃保存。 5.5 O/129纸片(10μg/片):4℃保存。 5.6 异丙醇。 5.7 10×TaqDNA聚合酶缓冲液(不含Mg2+):-20℃保存。 5.8 dNTPs(10mmol/L):-20℃保存。 5.9 TaqDNA聚合酶(5U/μL):-20℃保存。 5.10 MgCl2溶液(25mmol/L):-20℃保存。 5.11 核酸染料:4℃保存。 5.12 DNA分子质量标准溶液:分子质量大小在100bp~2000bp,-20℃保存。 5.13 70%、75%和95%(体积分数)乙醇。 5.14 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基:按附录A中A.1配制。 5.15 胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基:按A.2配制。 5.16 葡萄糖发酵培养基(GFM):按A.3配制。 5.17 1×TAE电泳缓冲液:按A.4配制。 5.18 1.5%琼脂糖凝胶:按A.5配制。 5.19 2%CTAB溶液:按A.6配制。 5.20 蛋白酶K(20mg/mL):-20℃保存。 5.21 核酸抽提液Ⅰ:按A.7配制。 5.22 核酸抽提液Ⅱ:按A.8配制。 5.23 6×上样缓冲液:按A.9配制,-20℃保存。 5.24 PCR正向引物(10μmol/L):5'-CATGCTGCCAATGGTCGTGG-3',-20℃保存。 5.25 PCR反向引物(10μmol/L):5'-AGTGAAATCTACCAGCGGTGCT-3',-20℃保存。 5.26 实时荧光PCR正向引物(10μmol/L):5'-TAAAGCACTGTCTGTTACC-3',-20℃保存。 5.27 实时荧光PCR反向引物(10μmol/L):5'-GCTACTTCACCCTGATTGG-3',-20℃保存。 5.28 实时荧光PCR探针(10μmol/L):5'-FAM-ACATCAGCAGGCTTCAGAGTCACTG- BHQ1-3',-20℃保存。 5.29 阳性对照:含杀鲑气单胞菌的组织或杀鲑气单胞菌培养物或含目的片段的质粒菌。 5.30 阴性对照:不含杀鲑气单胞菌的组织或其他革兰氏阴性细菌培养物。 5.31 空白对照:无菌超纯水。 6 仪器设备 6.1 恒温培养箱。 2GB/T47226—2026 6.2 组织研磨器。 6.3 高速冷冻离心机:4℃,离心速度12000×g以上。 6.4 高压灭菌锅。 6.5 PCR仪。 6.6 荧光定量PCR仪。 6.7 核酸电泳仪。 6.8 凝胶成像系统。 6.9 显微镜。 6.10 冰箱:4℃,-20℃。 7 临床症状 杀鲑气单胞菌病(Aeromonassalmonicidadisease)是鱼类感染杀鲑气单胞菌引起的一种细菌性疾 病,主要危害鲑科鱼类,杀鲑气单胞菌病概述见附录B。该病的主要临床症状如下: 患病鱼离群独游,活动缓慢、进食减少;体色变暗或发黑,随着病情发展在体侧出现大小不等的凸起 黑斑;鳍条基部充血、开裂;鱼体两侧,特别是背鳍基部两侧的肌肉组织上,出现红肿脓疮,向外隆起,并 逐渐出血坏死、溃烂;肛门红肿突出;剖检可见肠道充血发炎,肝脏、肾脏和脾脏肿大、出血。 8 样品 8.1 采样对象 采集易感鱼类,优先采集有临床症状的个体。 8.2 采样部位 8.2.1 无临床症状 无菌采集肝脏、脾脏、肾脏等样本。 8.2.2 有临床症状 75%乙醇(5.13)消毒病灶表面,无菌采集病变组织,同时采集肾脏、脾脏、肝脏等样本。 8.3 采样数量 出入境检验检疫按GB/T18088规定执行;产地检疫按SC/T7103规定执行。 8.4 保存和验收 样品宜活体运输到实验室,冰鲜样品0℃~4℃保藏24h内运输到实验室,立即取样检测。 9 细菌分离 9.1 分离培养 用无菌接种环或接种针蘸取不同部位采集的样品,分别划线接种于TSA培养基(5.14)上,25℃± 2℃培养72h。培养基也可采用商品化TSA培养基。 3GB/T47226—2026 9.2 纯化 在TSA培养基上挑取光滑、圆润、凸起、半透明的单个菌落,划线接种于TSA培养基上进行纯化 培养。 10 生理生化鉴定 10.1 革兰氏染色和形态观察 10.1.1 用接种环挑取菌落少许,加在有1滴