ICS 07.100.20 SN CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5523—2023 水中铜绿假单胞菌的测定 酶底物法 DeterminationofPseudomonasaeruginosainwaterEnzymesubstratemethod (iSO16266-2:2018Waterquality—Determinationandenumerationof PseudomonasaeruginosaPart2:Mostprobablenumbermethod,NEQ) 2023-11-01发布 2024-05-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 5523—2023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件参考ISO16266-2:2018《水质 铜绿假单胞菌检测和计数 女第2部分：最可能数法》，一致性 程度为非等效。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国郑州海 关、中华人民共和国济南海关， 本文件主要起草人：冯家望、游淑珠、王小玉、黎财慧、姚丽锋、曾静、蔡教英、丁琦、苗丽、张群、 符家忍。 H SN/T 5523—2023 水中铜绿假单胞菌的测定 酶底物法 1 范围 本文件规定了水中铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)检测的酶底物法。 生活饮用水、泳池水和温泉水等水质中铜绿假单胞菌的检测可参照使用。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB4789.28 3食品安全国家标准食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8538饮用天然矿泉水检验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa 可在铜绿假单胞菌培养基中生长并且能够表达7-氨基-4-甲基香豆素氨肽酶的细菌。 4培养基、试剂和耗材 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。 4.1铜绿假单胞菌培养基：见A.1。 4.2消泡剂B:1%水溶性硅胶溶液。 4.3胰蛋白陈大豆琼脂(TSA）：见A.2。 4.4阳性对照菌株：铜绿假单胞菌ATCC10145(WDCM00024)、ATCC27853(WDCM00025)或其他 等效菌株。 4.5阴性对照菌株：荧光假单胞菌ATCC13525(WDCM00115)或其他等效菌株。 4.65 51孔定量盘：定量培养用无菌塑料盘，含51个孔穴，容积共100mL。 5仪器设备 5.1恒温培养箱：38℃±0.5℃。 5.2程控定量封口机。 5.3紫外灯箱：配6W、波长365nm紫外灯。 1 SN/T5523—2023 6采样、保存和运输 样品的采集、保存和运输按照GB/T8538。检测需在采样后12h内开始检测。如采样后12h内 无法开始检测，样品可在5℃±3℃下保存24h，如采用这种方式则需在检测报告中说明。 7检测步骤 7.1水样稀释 检测所需水样为250mL或100mL。天然矿泉水和包装饮用水应检测250mL生活饮用水、泳池 水和温泉水等水样推荐检测100mL。若水样污染严重，可用无抑制剂、无氧化剂的无菌去离子水作为 稀释剂对水样进行稀释。 7.2100mL水样的MPN检测 7.2.1无菌量取水样100mL加入铜绿假单胞菌培养基，振摇使之完全混匀。为减少孔内的气泡，可 以将样品加入到预先加有消泡剂B的无菌容器中，也可用滴瓶将消泡剂B添加到样品瓶中。 7.2.2将上述样品与培养基的混合物全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔内 气泡，将定量盘放于橡胶衬垫上，开口向上，用程控定量封口机封口。放入38℃±0.5℃恒温培养箱中 培养24h。 7.3250mL水样的MPN检测 50mL的样品中，加入50mL无抑制剂、无氧化剂的无菌水，制备成一个100mL的样品，标识该水样使 其与另2个100mL有效区分。 7.3.2上述3个水样分别与铜绿假单胞菌培养基和2滴~3滴消泡剂B混合均匀。 7.3.3当培养基完全溶解后，分别将3个样品和培养基的混合液倒入51孔无菌定量盘中，每个样品和 培养基的混合液全部倒入1个51孔无菌定量盘中。以手抚平定量盘背面以赶除孔内气泡，将定量盘放 于橡胶衬垫上开口向上，用程控定量封口机封口。 7.3.4将全部封好口的51孔定量盘放入38℃±0.5℃恒温培养箱中培养24h。 8结果判读、质量控制和结果报告 8.1结果判读 判定为铜绿假单胞菌阳性。 如果培养24h后，实验结果无法判读，可将定量盘延长培养至28h再进行判读。为方便荧光识别 和判读，可将定量盘放在橡胶衬垫中进行结果判读。 8.2质量控制 每次检验均应使用铜绿假单胞菌菌株、荧光假单胞菌菌株和无菌水分别用做检验的阳性对照、阴性 对照和空白对照，阳性对照应呈蓝色荧光，阴性对照和空白对照应无蓝色荧光。 2 SN/T 5523—2023 8.3结果报告 8.3.1100mL水样的MPN检测 100mL水样的51孔定量盘MPN定量检测，应计数所有显蓝色荧光的孔数，按表B.1规定执行， 查出其代表的铜绿假单胞菌的最可能数（MPN），以MPN/100mL报告结果。如水样未经稀释，且查表 值<1,可报告结果为0MPN/100mL。如检测的水样经稀释，则按查表值乘以稀释倍数报告结果 8.3.2250mL水样的MPN检测 计算2个未稀释的样品的阳性孔数总和计为未稀释样品阳性孔数。将50mL稀释样品的阳性孔 数计为稀释样品的阳性孔数。按表C.1规定执行，以MPN/250mL报告最终结果。如水样未经稀释 且查表值<1,可报告结果为0MPN/250mL。如检测的水样经稀释，则按查表值乘以稀释倍数报告 结果。 m SN/T 5523—2023 附录A (资料性) 培养基 A. 1 铜绿假单胞菌培养基 A.1.1成分 酵母提取物 2.50 g 2.50 g 乳蛋白 5.00 g 氯化钠 1.00 g 硫酸镁 硝酸钾 0.20 g 0.20 g 硫酸铵 6.86 g 无酸HEPES[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)] HEPES钠盐 5.29 g 核黄素 0.002 q 0.003 4g 二氢叶酸还原酶抑制剂 磺酰胺 0.018 g 0.010 g 糖肽 氨基糖苷 0.010 g 头孢菌素 0.015 g 7-氨基-4-甲基-3-香豆素氨基肽酶底物 0.080 g 0.010 g 放线菌酮(环己酰亚胺) A.1.2制法 每1000mL铜绿假单胞菌培养基共24.4491g,可以按上述的成分制备，也可以使用商品化的培 养基。 A. 1.3 质量控制 铜绿假单胞菌培养基的性能测试参照GB/T4789.28进行，所用菌株见表A.1。 表A.1铜绿假单胞菌培养基的性能测试 测试指标 培养条件 质控菌株。 参比培养基质控方法 参考值 特征 铜绿假单胞菌 38 ℃ ±0. 5℃ 生长率 ATCC 10145(WDCM 00024)或 TSA 定量 生长率≥0.5 呈蓝色荧光 24h~28h ATCC 27853(WDCM 00025) 荧光假单胞菌 38℃ ±0. 5° 选择性 定性 完全被抑制 无蓝色荧光 ATCC13525 (WDCM 00115) 24h~28 h a 表示可采用其他等效菌株。 4 SN/T 5523—2023 A. 2 胰蛋白陈大豆琼脂(TSA) A. 2. 1 成分 蛋白陈 10.0 g 5.0 g 氯化钠 9.0 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 1.5 g 磷酸二氢钾 蒸馏水 1000mL A. 2. 2制法 加热搅拌至溶解,调节pH至7.2±0.2,121℃高压灭菌15min。 5