ICS 65.020 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5012—2017 香蕉枯萎病菌生理小种检疫鉴定方法 Detection and identification of Fusarium oxysporum f. sp. cubense (E.F.Smith) Snyder& Hansen Race 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T5012—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国南通出人境检验检疫局、华南农业大学、中华人民共和国江 苏出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：肖杰文、李敏慧、徐宁、姜子德、禹海鑫、孙民琴、吴翠萍、李彬。 S SN/T5012—2017 香蕉枯萎病菌生理小种检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物检疫中香蕉枯萎病菌生理小种的分子检测与鉴定方法。 本标准适用于香蕉种苗、组培苗及其他香蕉种质资源、商品用香蕉等中的香蕉枯萎病菌生理小 种的分子检测与鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2665香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法 3基本信息 学名：Fusariumoxysporumf.sp.cubense（E.F.Smith）Snyder&Hansen.FoC. 分类地位：镰刀菌属（Fusarium），尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）。 香蕉枯萎病菌的生理小种分类、寄主范围、为害症状和传播方式等其他信息参见附录A。 4原理 以香蕉枯萎病菌的危害症状、 菌落的形态特征、寄主范围和分子检测结果等作为该病害的鉴定 依据。 5 仪器和用具 5.11 仪器 体视显微镜、生物显微镜（带显微照相设备）、PCR仪、超净工作台、生化培养箱、灭菌锅、制 冰机、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、 电泳仪、凝胶成像系统。 5.2用具 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、离心管、移液 器、移液器吸头、液氮罐。 SN/T5012—2017 6试剂和培养基 6.1试剂 PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、引物、葡萄糖、琼脂糖、 琼脂、无水乙醇、70%乙醇、0.1%升汞、灭菌水、40%甘油。 6.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PotatoDextroseAgar，简称PDA）。具体配制方法见附录B。 抽样与检查 7 7.1现场抽样 按照SN/T2122规定进行取样。 7.2 现场检查 取样时应进行针对性检查，注意检查有无可疑病株。若有可疑病株应将其挑出来，并送实验室 作进一步检验鉴定。在以上针对性检查基础上，再按照相关标准规定进行取样。 8实检室检验 8.1症状检查 受侵染植株的症状参见附录A。 8.2 2病原菌的分离培养 按照SN/T2665中描述的方法进行分离培养。 8.3 PCR检测 PCR检测方法见附录C。 9鉴定特征 9.1 营养体及繁殖体形态 营养体及繁殖体形态特征参见SN/T2665。 9.2 2PCR检测 引物扩增有相应大小的产物带出现，可判定为阳性。其中，尖孢镰刀菌通用引物的扩增片段大 小为729bp；1号生理小种特异性引物的扩增片段大小为354bp；2号生理小种特异性引物的扩增片段 大小为511bp；4号生理小种特异性引物的扩增片段大小为593bp。 10 ）结果判定 如果分离物的各形态特征与9.1描述相吻合，且通用引物的PCR扩增结果为阳性，片段大小为 2 SN/T5012—2017 729bp，同时，若1号生理小种特异性引物的PCR扩增结果为阳性，片段大小为354bp，且DNA序列 测定结果与1号生理小种阳性对照序列一致，则判定送检样品为香蕉枯萎病菌1号生理小种；若2号 生理小种特异性引物的PCR扩增结果为阳性，片段大小为511bp，且DNA序列测定结果与2号生理小 种阳性对照序列一致，则判定送检样品为香蕉枯菱病菌2号生理小种；若4号生理小种特异性引物的 PCR扩增结果为阳性，片段大小为593bp，且DNA序列测定结果与4号生理小种阳性对照序列一致， 则判定送检样品为香蕉枯菱病菌4号生理小种。 11 样品及菌株的保存 保存样品应按品种分别存放，保存样品经登记和经手人签字后置低温干燥、防虫处保存2个月， 如果鉴定为香蕉枯萎病菌，该样品至少需保存6个月，同时保留电泳图片，以备复验、谈判和仲裁。 保存期满后，需经灭菌处理 对判定为香蕉枯菱病菌的菌株的存放要进行标注，包括菌株来源、寄主的品系、分离时间，分 离人和鉴定人；将菌株孢子移至40%甘油管保存在-80℃冰箱，可 或将菌株培养在试管斜面上，长满后 存于4℃冰箱。 S 3 SN/T5012—2017 附录A （资料性附录） 香蕉枯萎病菌其他信息 A.1分类与寄主范围 香蕉枯菱病菌[Fusariumoxysporumf.sp.cubense（EF.Smih）Snyder&Hansen，FOC]隶属镰刀菌属 （Fusarium），尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）. 依据该菌在不同类型香蕉品系甚至不同属种上的为害情况，可分为3个生理小种：1号小种（FOC1） 可感染粉蕉（Musa，ABB）以及香蕉的栽培种“大蜜哈”（CrosMichel，AAA）龙牙蕉（Musa.AAB）和矮香 蕉（DwafCavendish，AAA），该生理小种呈世界性分布；2号小种（FOC2）为害三倍体杂种棱指蕉（Bluggoe， AAB），但不侵染“大蜜哈”，该生理小种呈区域性分布，仅分布在洪都拉斯、萨尔瓦多、波多黎哥、多米 尼加共和国和维尔京群岛等中美洲国家和地区：4号小种（FOC4）是1967年首先在我国台湾地区报道的 个新小种，除了可感染粉蕉外，还能侵染“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉（BB）和棱指蕉等所有香蕉和大蕉品种 及对其他小种有抗性的香牙蕉（Cavendish，AAA），因此其危险性和毁灭性最大，该生理小种在我国大陆的 香蕉产区已有报道，但还局限在一定的区域；另外，原来的3号小种（FOC3）因只为害野生观赏性羯尾蕉 属（Heliconiaspp.）植物，而对香蕉栽培品种不造成危害，故已不属于香蕉枯萎病菌。 A.2症状特征 A.2.1外部症状 该病菌侵染香蕉根系和球茎，堵塞输导组织，使罹病植株表现黄叶症状。植株感病早期无明显 外部症状，染病一段时间后，病害先从下部较老的叶片开始发生，发病初期叶片边缘变黄并逐渐扩展 至主脉，病叶叶柄在靠近叶鞘处容易折曲、下垂，后期病叶凋萎后倒挂在假茎旁，直致全株枯死；有 时假茎基部开裂。若是假植的组培苗染病，其叶片褪绿、无光泽，呈黄绿色或局部甚至整叶黄化；严 重时整个假茎全部变为褐色，部分根变褐腐烂。 A.2.2内部症状 香蕉枯萎病菌是侵染维管束的病害，感病初期在病株下部根茎处横剖开观察，可见中柱髓部和 皮层薄壁组织间，有黄色或红棕色的斑点，为被病原菌侵染后坏死的维管束。这种变色也有集中在髓 部和外皮层之间的，内皮层内面维管束形成一圈坏死。若纵向剖开病株根茎，可看到初发病的组织有 黄红色病变的维管束，近茎基部，病变颜色很深，越向上病变颜色渐渐变淡。在根部木质导管上，常 产生红棕色病变，一直延伸至根茎部；至后期，大部分根变黑褐色而干。病茎旁所生吸芽的导管也 会受侵染，纵部球茎，可以看到红棕色的维管束从母株延伸侵染的迹象。病害严重的植株，整个球茎 内部明显地变为深红色及棕褐色，中柱和内层的叶鞘变褐色；剖开病组织，有一种特异而不是臭的气 味。只有在其他微生物再次侵染后，才腐烂发臭。 A.3传播方式 香蕉枯萎病菌是典型的土传性维管束病害，初侵染源多来自病株及带菌的土壤、苗木、流水、 农具等。其中，病株残体、带菌土壤、耕作工具、病区灌溉水、雨水、线虫等导致近距离传播；带病 菌的吸芽、土壤及二级苗成为远距离传播方式。 4