ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T49932017 转基因玉米检测 微滴式数字PCR定量方法 Detection of geneticallymodifiedcorns- Quantitative method with droplet digital PCR 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T 4993—2017 前言 本标准根据GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检 验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：凌杏园、潘广、章桂明、付伟、程颖慧、黄新、向才玉、陈枝楠、朱水芳。 SN/T4993—2017 转基因玉米检测 微滴式数字PCR定量方法 1范围 本标准规定了转基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、 MON863、T25、MIR604、ES3272、NK603、TC1507、MON87460、59122和GA21微滴式数字PCR定量检 测方法。 本标准规定了玉米产品中转基因玉米成分含量的计算方法 本标准适于农产品和食品中上述转基因玉米品系的定量检测 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 19495.3 转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T 19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1术语和定义 微滴式数字PCRdropletdigitalPCR 一种核酸单分子扩增技术。一PCR反应管中90uL的油水反应体系被微滴发生器制备成近20000 油包水小微滴。当待测双链DNA模板分子数低于一定的数目，模板DNA分子按泊松分布定理分散到 各小微滴中。这些含有模板DNA的小微滴（绝大多数仅含一个模板分子）包含了足量的供实时荧光 PCR反应所需的所有其他组分如dNTP、TagDNA聚合酶以及探针和引物等，待荧光PCR反应结束后， 逐一检查每个微滴是否有扩增发生，就可以精确测得待测DNA模板的分子数，不同于常规PCR和实 时荧光PCR技术，该技术不需要制作标准曲线，也与待测分子PCR扩增效率无关，可以直接测出样 品中待测DNA模板的绝对数目，可对产品中转基因成分进行精确定量。 3.2 2缩略语 DNA（deoxyribonucleicacid）：能氧核糖核酸。 dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸。 dUTP（deoxyuridinetriphosphate）：脱氧尿苷三磷酸。 EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid）：乙二胺四乙酸 1 SN/T4993—2017 Taq酶：源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。 TE:Tris-HCl、EDTA缓冲液。 TM：溶解温度（meltingtermperature）。 Tris：三（羚甲基）氨基甲烷[ftris（hydroxymethyl）aminomethane]。 UNG:尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）酶（uracil-N-glycosylase）。 HMG：玉米高泳动蛋白基因（highmobictygroupproteins）。 4方法原理 本标准采用双通道法，即对检测玉米内源基因和品系特异性序列（边界序列）的探针进行不同的 荧光标记，在同一个PCR反应体系中同时测定内源基因和品系特异序列的分子数。由于玉米内源基 因HMG和品系特异性序列在玉米基因组中均只有一个拷贝，通过计算样品中品系特异性序列和HMG 基因序列分子数的比值就可得出特定转基因玉米品系的拷贝倍数百分含量。 5主要设备及试剂 5.1主要设备 微滴式数字PCR检测系统（包括微滴发生器、封膜仪、普通PCR仪和微滴荧光检测器）。 低温冷冻高速离心机、核酸测定仪、制冰机。 5.2 2主要试剂 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。实验用 水应符合GB/T6682中一级水的规格，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装 5.2.12×ddPCR预混液。 5.2.2 CTAB提取液：20g/LCTAB，1.4mol/LNaCL，0.1mol/LTris-HCL，0.02mo1/LNa2-NDTA，pH8.0。 5.2.3 CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmo1/LNaC1。 5.2.4 蛋白酶K溶液：20mg/mL。 5.2.5 RNase A: 100 mg/ml。 5.2.6 NaCl溶液：1.2mol/LL 5.2.7 三氯甲烷（氯仿）（氯仿：异戊醇：24：1）。 5.2.8 异丙醇。 5.2.9 70%无水乙醇。 5.2.10TE缓冲液：10mmo1/LTris-HC1（pH8.0），1mmo1/LEDTA（pH8.0）。 5.2.11探针和引物：转基因玉米内源基因HMG与品系特异性目标序列数字PCR检测用探针和引物信 息见附录A。 6抽样与制样 按GB/T19495.7执行。 2 SN/T4993—2017 DNA提取及浓度测定 7 7.1 DNA提取 7.1.1 CTAB方法 按CB/T19495.3执行， 7.1.2 试剂盒法 采用不同试剂盒提取基因组DNA时，按其操作说明书操作。 7.2 DNA浓度测定 样品DNA用精准核酸测定仪测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度。计算 公式如下： DNA纯度以OD260/OD280比值表示。 DNA浓度=50×OD260mg/mL DNA纯度比值应在1.7~1.9之间，浓度不低于10ng/μL。 8 数字PCR检测 8.1 PCR反应体系 每个提取DNA样品检测时设置3个平行PCR反应。检测玉米内源基因HMG与品系特异序列探 针和引物加人同一个20μL反应体系中，PCR反应体系见表1。反应体积20μL，其中2×ddPCR预混 液（5.2.1）10μL，玉米品系和内参照（HMG）基因正反向引物各1μL（终浓度300nmo1/L），探针各 1μL（终浓度180nmo1/L），DNA模板（15ng/uL）2μL。 表1二重数字PCR反应体系 试剂 加入体积/μL 反应体系中的终浓度/（nmol/L） 2×ddPCR预混液 10 1× HMG探针（3.6μmol/L） 180 nmol/L HMG基因正向引物（6μmol/L） 300 nmol/L HMG基因反向引物（6μmol/L） 300 nmol/L 品系探针（3.6μmol/L） 1 180 nmol/L 品系正向引物（6μmol/L，） 300 nmnol/L 品系反向引物（6μmol/L） 1 300 nmol/L DNA模板（15ng/uL） 2 12000个玉米基因组分子（同微滴数） 补水至 20 每个玉米基因组DNA分子约2.5pg，同 同微滴数基因组DNA等于12000×2.5=30000pg，日 即30 ng。 3 SN/T4993—2017 8.2微滴发生 在上述20μL反应体系中加入70μL矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；将产生 的微滴仔细全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通 PCR仪上进行PCR反应。 8.3PCR扩增反应条件 反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，56℃退火1min，40个循环，最后95℃10min 灭活反应酶，扩增结束后，将96孔板取出置入微滴分析仪中读取信号，并用适当软件分析实验结果， 9结果分析与计算 9.1质量控制 每次定量检测均需设置对照，对照的设置应符合GB/T19495.2中的规定。 每PCR反应管微滴数不少于12000个；加入玉米基因组DNA拷贝数不高于微滴数的5倍，即 150ng~250ng 核酸提取对照、PCR空白和阴性对照理论上检测结果应为零。但考虑到数字PCR的超灵敏性， 特别是提取对照和环境对照检查结果为零有时难以实现，因而允许有极少量阳性微滴数出现，但阳性 微滴数应低于1/4000（基于经验，12000个微滴不能多于三个阳性微滴），有效阳性检测结果至少是 对照阳性微滴数的三倍（即至少9个阳性微滴）。因此，按本标准方法，使用30ng玉米基因组DNA的 检测低限为0.1%，使用150ng玉米基因组DNA的检测低限为0.02%。 每样品提取两个DNA样品，二DNA样品检测所得转基因成分含量的相对相差应小于等于25%。 相对相差计算见式（1）： ** (1) m 式中： 一一第一个测试样品的检测结果； b—一第二个测试样品的检测结果； ma和b的平均数。 同一个提取DNA样品重复三次PCR反应，其测定结果的相对标准偏差应小于等于25%。 以上质控条件中有一项不符合，试验结果应放弃，并应从制备测试样品开始重做实验， 9.2结果计算 9.2.1总则 一个阳性微滴代表检测到一个内源基因分子或品系特异序列分子。样品最终阳性微滴数值取样品 二次提取DNA共六次数字PCR反应的平均数。 9.2.