SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4881—2017 鸡球虫病检疫技术规范 Quarantineprotocol for chicken coccidiosis 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4881—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国中山出人境检验检疫局、中华人民共和国无锡出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨春华、蔡先全、童明龙、孙思扬、孙洁、罗秋红、张强、祝建新、李仕祥、夏彪。 1 SN/T4881-2017 鸡球虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸡球虫病的粪便检查、组织检查、聚合酶链式反应（PCR)的操作规程 本标准适用于鸡球虫病的检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3病原 鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria)球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。简 介参见附录A。 4 设备、材料和试剂 4.1设备 电炉、显微镜、天平、离心机、移液器、冰箱（4℃、一20℃）、水浴锅（或金属浴）、PCR仪、凝胶成像 系统。 4.2 材料 铜丝筛（60目）、尼龙筛（60目）、量筒、烧杯、接种环、研钵、平皿、吸管、载玻片、盖玻片、麦氏虫卵计 数板。 4.3 3试剂 4.3.1实验室用水 应符合GB/T6682的规定。 4.3.2 饱和盐水 称取400gNaCl,放人烧杯中，加人1000mL水，加热搅拌至全部溶解后，静置冷却，有少量盐析 出，即为饱和盐水。 4.3.3磷酸盐缓冲液 将下列试剂依次加人到1000mL烧杯中： 氯化钠 8.00 g 氯化钾 0.20 g 1.44 g 磷酸氢二钠 1 SN/T 4881—2017 磷酸二氢钾 0.24 g 蒸馏水 至1000mL 充分搅匀，调pH值至7.4，并定容至1000mL。103.41kPa压力下蒸气灭菌20min，室温保存， 待用。 4.3.42.5%重铬酸钾溶液 称取5g重铬酸钾固体，溶于200mL水中，搅拌至重铬酸钾完全溶解。 4.3.5DNA提取试剂或成品试剂盒 裂解缓冲液、0.5mol/LEDTA、蛋白酶K溶液、核糖核酸酶溶液。 4.3.6PCR反应预混液 4.3.7鸡球虫通用引物1) 上游引物P1:5'-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3 下游引物P2:5-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3” 4.3.8鸡球虫分型检测引物 鸡球虫分型检测引物见表1。 表1鸡球虫分型检测引物 种类 引物名称 引物序列5元-3” 长度/bp ACF CTGCGAGGGAACGCTTAAT 堆型艾美耳球虫 303 (E.acervulina) AcR AACGAACGCAATAACACACG Br-F CTGGGGCTGCAGCGACAGGG 布氏艾美耳球虫 183 (E.brumetti) Br-R ATCGATGGCCCCATCCCGCAT Mx-F TTGTGGGGCATATTGTTGTG 巨型艾美耳球虫” 151 (E.marimu) Mx-R CAATGAGGCACCACATGTCT Mt-F GTTTATTTCCTGTCGTCGTCTCGC 和缓艾美耳球虫 330 (E.mitis) Mt-R GTATGCAAGAGAGAATCGGGATTCC Ne-F 毒害艾美耳球虫 AGTATGGGCGTGAGCATGGAG 160 (E.mecatrir) Ne-R GATCAGTCTCATCATAATTCTCGCG Pr-F 早熟艾美耳球虫” CATCGGAATGGCTTTTTGAAAGCG 215 (E.praeror) Pr-R GCATGCGCTAACACCTCCCCTT Tn-F 柔嫩艾美耳球虫 CGCTGCTGGTTTTACAGGTT 163 (E. lenella) Tn-R GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC 参考义献[2]。 ：参考文献[3]。 通用引物为真核生物18SrDNAPCR通用引物.目的片段长度及序列信息参见附录B中B.1，引物序列引自参 考文献[1]。 2