SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.3—2017 基因条形码筛查方法 第3部分：检疫性植原体 DNA barcoding screening method- Part 3 :Quarantine phytoplasma 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.3—2017 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体。 本部分为SN/T4877的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任， 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国广 西出人境检验检疫局、福建省农业科学院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：赵文军、李为民、杜智新、谢丽雪、田茜、廖芳。 SN/T4877.3—2017 基因条形码筛查方法 第3部分：检疫性植原体 1范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因扩增、序列的 比对分析及结果判定等。 本部分适用于检疫性植原体的筛查鉴定。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1DNA条形码 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 2.2 216SrRNA基因 原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保守， 被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，16SrRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，在植原体 的分类鉴定中广泛应用。 2.3 3tuf基因 延伸因子基因，是植原体转录过程中的关键因子，为单拷贝，序列相对保守，常用于植原体的分类 鉴定。 3植原体基本信息 为软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科 录A。 4方法原理 16SrRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及tuf基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主 要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。 5 仪器用具及试剂 5.1 仪器用具 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、冰箱、 1 SN/T4877.3—2017 旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。 5.2试剂 植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker。 核酸提取研磨液（100mL）：K,HPO，·3HzO,2.17g;KHzPO,，0.41g；蔗糖，10g；BSA（FractionV)， 0.15g；PVP-10,2g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。 DNA提取液：Tris-HCl100mmol/L;EDTA，100mmol/L;NaCl,250mmol/L；调pH至8.0。 50XTAE:2.0mmol/LTris,1.0mmol/LNaAc,50mmol/LEDTA,pH8.0。 6筛查鉴定方法 6.116SrRNA基因序列扩增测序 利用通用引物进行16SrRNA基因序列护增测序（具体步骤见附录B），将序列在Genbank数据库 或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中进行blast比对 6.2虚拟RFLP指纹图谱分析 见附录B。 6.3tuf基因序列扩增分析 见附录C。 7结果判定 根据16SrRNA基因序列blast比对结果进行初步判定。如果相似度高于97.5%，初步判定为一个 候选种或组。 根据iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件分析结果进行判定。相似度达到0.85 时，判定为同一个组，0.85～0.97之间为不同亚组，然后根据名录中检疫性植原体对应的组或亚组进行 判定。也可以利用Iuf基因序列在欧盟检疫性有害生物鉴定数据库（QBOL)或中国检疫性有害生物 DNA条形码鉴定数据库中比对判定，NJ树聚在同一支上为同一组或亚组。 筛查鉴定结果需结合寄主、症状及病原形态等生物学信息进行最终判定。 8样品保存与复核 8.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。 该类样品保存期满后需经高压灭荫后方可处理。 8.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，测定序列需要保存电子文件。 2 SN/T4877.3—2017 附录A （资料性附录） 检疫性植原体相关信息 A.1 植原体分类鉴定信息 目前植原体有两种分类鉴定系统，一种为基于16SrRNA基因序列相似度进行分种，相似度高于 97.5%，并结合生物学信息，认为是同一个候选种（Candidatusphytoplasmasp.）。另一种为基于 16SrRNA基因序列RFLP电子指纹图谱的相似性进行分组，相似性高于0.85为同一组，相似性在 0.85～0.97之间为不同亚组，该套分类方法更具有实用性。候选种大部分与组或亚组相对应。 A.2 检疫性植原体分类信息 检疫性植原体分类信息见表A.1。 表A.1检疫性植原体分类信息 中文名称 通用名 分组 候选种 橙树黄化植原体 Alder yellows 苹果丛生植原体 Apple proliferation XA Ca.Phytoplasma mali 杏褪绿卷叶植原体 Apricot chlorotic leafroll IF 白蜡树黄化植原体 Ash yellows VI-A Ca.Phytoplasma fraxini Blueberry stunt 蓝莓矮化植原体 I-E/IX-E 澳大利亚植原体候选种 Candidatus Phytoplasmaaustralicnse XII -B Ca.Phytoplasma pruni 椰子致死黄化植原体 Coconut lethal yellowing IV 榆韧皮部坏死植原体 Elm phlocm nccrosis V-C 葡萄金黄化植原体 Grapevine flavescence doree V-D 来檬丛枝植原体 Lime witches"broom II-B Ca.Phytoplasma aurantifolia 桃X病植原体 Peach X-diseasc V- II 梨衰退植原体 Pear decline X-C Ca.Phytoplasma pyri 马铃薯丛枝植原体 Potato witehes"broom V-^ 草莓籁生植原体 Strawberry multiplier I-K 3