SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4857—2017 国境口岸肠出血性大肠埃 希菌0104：H4检验方法 Method for detection of EHEC O104 :H4 at frontier port 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4857—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心传染病控制所。 本标准主要起草人：涂承宁、赵俊华、冯子力、熊衍文、闫文莲、莫秋华、谭华、叶立青 I SN/T 4857—2017 国境口岸肠出血性大肠埃 希菌0104：H4检验方法 1范围 本标准规定了国境口岸检验的检测流程、样品采集与运输、样品处理、检验和报告。 本标准适用于对国境口岸粪便及呕吐物、可疑食品和水样中志贺样毒素的筛查、EHECO104：H4 筛查和分离培养。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB4789.1食品安全国家标准 食品微生物学检验总则 GB/T4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T5750.2生活饮用水标准检验方法 水样的采集和保存 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肠出血性大肠埃希菌 Enterohemorrhagic escherichia coli;EHEC 一种能产生志贺样毒素（Shigatoxin，义称维罗毒素，Veto毒素，Verotoxin）的致泻性大肠埃希菌， 可引起出血性肠炎（hemorrhagiccolitis，HC）和溶血性尿毒症综合征（hemolyticuremicsyndrome， HUS）。根据其菌体抗原（O)血清型和鞭毛抗原（H)血清型，可分为（)157：H7、O104：H4等一百余种， 详参见附录A。 4对象 4.1 EHECO104：H4感染或疑似感染病例的排泄物、呕吐物。 4.2 被EHECO104：H4污染或有EHECO104：H4污染嫌疑的食品和水样。 5检测流程图 EHECO104：H4检测流程图见图1。 SN/T4857—2017 粪便和呕吐物 其他样本 增菌 36℃±1℃ Vero毒素筛查 0104筛查(可选） 免疫磁珠富集(可选） 麦康凯或EMB 36℃±1℃,18h~24h 挑取可疑菌落进行氧化酶，染色并分纯培养 生化试验 血清学试验 Vero毒素检测 其他基因或毒力因子检测(可选) 报告 图1EHECO104：H4检测流程图 6样本采集 6.1样本采集原则 6.1.1采集标本以病人粪便为主，粪便标本应争取在发病早期、服用抗菌药物之前采集，并尽快送到实 验室。可同时采取可疑食品、水样和环境样本进行检测。 6.1.2水样便采取1mL～3mL，成形便采取指甲盖大小的粪便量。病人的呕吐物、沾染粪便的衣物和 尸体的肠内容物亦可作为检材。 6.1.3采集样本时应注意避免交叉污染。 6.1.4采集样本时，应戴上乳胶手套和口罩。样本采集完毕，尽快消毒洗手。 2 SN/T4857—2017 6.2粪便的采集 6.2.1拭子采样法 用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm～5cm处采取。应注意棉拭大小适宜，避免采便量 过少。 6.2.2座厕采样法 6.2.2.1戴上乳胶手套，取一螺旋式密封、已消毒、干燥的容器并做好唯一性标识； 6.2.2.2使用座厕时，指导病人将经消毒的厨用塑料围裙挂在座厕后背上，将围裙体部置于座厕坐板 上，使能更方便地获得粪便样本，但应避免尿液混和。尽可能多地将粪便样本采集到上述容器中（推荐 采集到10mL以上），置2℃～8℃保存并于2h内送检 6.2.2.3如果没有座厕，可使用塘瓷便盆。指导病人将围裙体部置于便盆上（如果便盆经过高压消毒， 也可不用围裙），使能更方便地获得粪便样本，但应避免尿液混和。 6.2.2.4如果是使用了纸尿布且不会使用座厕的婴幼儿，可将塑料围裙沿着纸尿布边缘放入纸尿布中， 如果放置得当，可使粪便和尿液的混合减到最少，从而获得一个较好的样本。 6.3呕吐物样本采集 采集自然呕吐的呕吐物于灭菌容器中，水样呕吐物采集1mL～3mL，非水样呕吐物采集1g～3g。 6.4水样采集 按GB/T5750.2要求进行。 6.5可疑食品采集 按GB4789.1要求进行。 7运输与保存 采集的样本应按规定作好标识放专用送样箱中，2℃～8℃保存并于2h内送检。采得的标本不能 立即检查的，应接种于保存培养基内（如文腊氏保存液或Cary-Blair二氏半固体保存培养基）尽快送往 实验室。送检标本时应填写送检单。 8 检验程序 8.1准备 8.1.1 对检疫查验、卫生监督或疫情监测的记录进行整理 8.1.2 对所采集的样本应进行唯一性标识。 8.1.3 将所采集的样本连同整理的记录一并送实验室。 8.1.4 检验设备和材料的准备按附录B的规定。 8.2样品处理 8.2.1 粪便和呕吐物的处理 粪便和呕吐物应选择其中脓血粘液等病理成分进行检验，如无病理成分，可多部位取材。粪便和呕 3 SN/T4857-2017 吐物应直接取样划线接种MAC或EMB琼脂平板。同时进行增菌时，取检样1g/mL，加在9mLEC 肉汤中同时进行增菌培养。志贺样毒素筛查按附录C的C.1和附录D的D.1的要求进行 8.2.2可疑食品样本的处理 除了易腐食品在检验之前置2℃～8℃预冷藏外，其余食品一般不冷藏。固体样品以乳钵加灭菌 加在225mLEC肉汤中直接进行检验。 8.2.3水样的处理 污染严重的水样可取25mL，加在225mLEC肉汤中直接进行检验。可取300mL水样用过滤器 和0.22μm滤膜过滤，将滤膜剪碎与50ml.离心管中，用25ml.纯净水反复震荡2min洗脱，加人225mL EC肉汤中进行检验。 8.3增菌 粪便样本取1g/mL加人9mLEC肉汤中，其他样本无菌操作取25g/mL加人225mLEC肉汤 中，置36℃士1℃温箱内培养4h～6h。如采用ELISA进行Vero毒素筛查，加人丝裂霉素C，使其浓 度达到0.5μg/mL，并于36℃±1℃温箱内继续培养16h～20h。 8.4Vero毒素筛查 8.4.1聚合酶链反应(PCR)法 按附录C进行。 8.4.2酶联免疫吸附法（ELISA法）检测 无条件按附录C进行检测的实验室，可按附录D进行。 8.5EHEC0104:H4筛查 按附录E进行。 8.6分离培养鉴定 8.6.1分离培养 用增菌液接种MAC或EMB琼脂干板，腹泻便和呕吐物还应直接划线接种MAC或EMB琼脂平 板，采用磁珠涂布划线接种时，将磁珠涂布在培养基一半区域，再用接种环划线其余区域。于36℃土 1℃温箱内培养18h～24h，观察菌落。采用MAC分离时不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意 乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。采用EMB分离时，大肠埃希菌表现为黑色菌落，带或不带金属光泽。 8.6.2生化试验 于鉴别平板上挑取5个可疑菌落，接种三糖铁琼脂（TSI）。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、 半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基，于36℃土1℃温箱内培养18h～ TSI底层不产酸，或HzS、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶 试验和革兰氏染色。 4 SN/T4857—2017 8.6.3血清学试验 挑取经生化试验符合大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用出血性大肠埃希氏菌O104血清和H4血清 进行玻片凝集试验。如均出现凝集，可证实为肠出血性大肠埃希菌O104：H4。如果凝集效果不好，可 进行液体培养后再进行血清学试验：用移液器取20μL菌液，接入5mL增菌液中于36℃士1℃、 180r/min培养16h，取1mL培养后的菌液，9200g离心，弃上清。取20μLO104血清滴加到洁净的 玻片上，取上述菌体与血清进行凝集反应。 8.6.4Vero毒素检测 按附录C或附录D进行。 8.7 其他基因和毒力因子检测 参照附录F进行。 9报告 9.2如果未进行Vero毒素筛查或（)104筛查，直接进行分离培养鉴定，生化试验或血清学试验结果不 符，报告为“未检出肠出血性大肠埃希菌0104：H4”。 9.3Vero毒素筛查、O104筛查结果为阳性，分离培养鉴定未检出肠出血性大肠埃希菌O104：H4，需 重复检测。如仍未检出，报告为“未检出肠出血性大肠埃希菌（)104：H4”。 9.4生化试验、血清学试验、Vero毒素检测均符合肠出血性大肠埃希菌O104：H4特征，食品样品报告 为"25g/mL样品中检出肠出血性大肠埃希菌（104：H4”，检样不足25g/mL，按实际样本量报告，其余 样品报告为“检出肠出血性大肠埃希菌O104：H4”。 5