SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4819—2017 裸鼠过度角化症检疫技术规范 Quarantine protocol for hyperkeratosis in athymic nude mice 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4819—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫 局、福建医科大学附属第一医院、 本标准主要起草人：王武军、白泉阳、张强、高丽钦、张体银、郑腾、于师宇、张志灯、熊炜、林素洁 SN/T 4819—2017 裸鼠过度角化症检疫技术规范 1范围 本标准规定了裸鼠过度角化症的临床诊断、病原分离与鉴定、组织切片和聚合酶链式反应检测 方法。 本标准适用于裸鼠过度角化症的临床诊断、病原鉴定与检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3临床诊断 受感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑，粘附于皮肤表面。消瘦，群体发病率达80%，但死亡率为 1%。临床上可根据感染动物全身出现鳞片样黄白色皮屑粘附于皮肤表面的典型症状作初步诊断（参见 附录A）。 4实验室诊断 4.1 设备、材料和试剂 4.1.1 主要设备 4.1.1.1 天平：读数精度0.1g。 4.1.1.2 冰箱。 4.1.1.3 二氧化碳培养箱。 4.1.1.4 恒温水浴锅。 4.1.1.5 生物显微镜。 4.1.1.6 切片机。 4.1.1.7 Ⅱ级生物安全柜。 4.1.1.8 红外加热器。 4.1.1.9 台式冷冻高速离心机。 4.1.1.10 PCR仪。 4.1.1.11 电泳仪。 1 SN/T4819—2017 4.1.1.12 凝胶成像仪。 4.1.1.13 灭菌试管。 4.1.1.14 灭菌吸管。 4.1.1.15 单道可调微量移液器（2μL～20μL，20μL200μL，100μL1000μL)及其配套吸头。 4.1.2 材料和试剂 4.1.2.1 水：符合GB/T6682中三级水的规格要求。 4.1.2.2 除另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.1.2.3 普通琼脂绵羊血平板培养基、脑心浸液(BHI)培养基及其琼脂培养基的制备方法参见附录B。 4.1.2.4 革兰染色液。 4.1.2.5 过氧化氢酶试剂。 4.1.2.6 细菌生化鉴定管或商品化生化鉴定试剂盒。 4.1.2.7 细菌基因组DNA提取试剂盒。 4.1.2.8 商品化DNA扩增试剂盒：-20℃保存，不要反复冻融。 4.1.2.9 扩增牛棒状杆菌16SrRNA基因的1391bp片断的引物序列如下： C.bovis16S-F:5'-GATCCTGGCTCAGGACGAAC-3', C.bovis16S-R:5'-GTTACCAACTTTCATGACGTGAC-3" 4.1.2.10扩增rpoB基因的1167bp片断的引物序列如下： rpoB-F:5'-AAGTTCGAGCGCACCAACCA-3", rpoB-R：5"-TGGCCCACACCTCCATCT-3。 4.1.2.11其他试剂：无水乙醇、琼脂糖（电泳纯）、分子量标准（100-bp1500bp）。 4.1.2.12电泳缓冲液、电泳加样缓冲液，溴化乙锭（EB)染色液，配制方法参见附录B。 4.1.2.13牛棒状杆菌标准菌株，由相关菌种保藏机构提供。 4.2样品采集 4.2.1用于细菌分离用样品的采集 皮肤表面样品采集时，灭菌棉签于灭菌磷酸盐缓冲液中没泡后拧干，在裸鼠背部皮肤涂擦后按 4.3.1.1接种。粪便样品采集时，固定颈部皮肤和小鼠尾部，使小鼠竖直，直接将粪便接人灭菌1.5mL离 心管中，加人适量灭菌磷酸盐缓冲液后，于40℃保存和运送。采样数量、包装和运输参照GB/T18088。 4.2.2组织学样品的采集 使用CO)，室息法迫杀裸鼠后，眼科手术剪迅速剪下完整的裸鼠背部皮肤（如有血污可在灭菌PBS 中漂洗），大小约1.5cm×1.5cm，将其贴在硬纸片上，放人新鲜配制的饱和Bouin氏液中固定24h。 4.3细菌分离、培养和鉴定 4.3.1细菌分离、培养和初步鉴定 4.3.1.1细菌分离 凡是涉及生物安全的操作和处理均应符合GB19489的相关规定.本病原应在二级生物安全柜内 操作。皮肤表面搽拭样品直接划线接种普通琼脂绵羊血平板；粪便样品用一次性接种环或经红外加热 器灭菌并冷却的接种环蘸取样品后划线接种于普通琼脂绵羊血平板（参见附录B)，于37℃5%C：培 养48h，如菌落生长缓慢，可延长至72h后观察，使之形成单个菌落，以供后续鉴定用。 2 SN/T4819-2017 4.3.1.2增菌培养 斜面（参见附录B)，37℃5%CO2培养48h。 4.3.1.3初步鉴定 4.3.1.3.1培养特性：在37℃5%CO，培养48h后，牛棒状杆菌在普通琼脂绵羊血平板上形成针尖大 小、圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、周围无溶血环的菌落。在脑心浸液（BHI)培养基中，培养液 上部清亮，底部有丝状沉淀。 阳性。形态不规则，菌体细长，直或微弯，一端常膨大呈棒状，有时呈球杆状，常成排或成簇排列。细胞 着色不均，可见节段染色或异染颗粒。 4.3.1.3.3初步判断：菌落生长特征、革兰染色、菌体形态与上述描述相符合的菌株，可初步确定为牛棒 状杆菌。 4.3.2生化鉴定 4.3.2.1经4.3.1.3初步确定为牛棒状杆菌的菌株，进行如下生化鉴定试验：溶血实验、水解实验[七叶 苷、明胶（25℃）、硝酸盐还原、脲酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖试验。或应用商品化的细菌生化鉴定 系统进行生化鉴定。 棒状杆菌和伪结核棒状杆菌的主要生化反应特性。 4.4组织切片检查 4.4.1组织切片的制备 取出在Bouin氏固定液中固定的样本，用刀片将样本修切成约1cm×1cm×0.5cm大小，酒精梯 度（50%、70%、80%、95%、100%和100%）脱水，每级2h，=甲苯透明40min~45min；于56℃~58℃ 温箱中浸蜡4h；石蜡包埋后切片，厚度5μm，苏木素-伊红（HE）染色后，镜检。 4.4.2结果观察 显微镜下，正常的裸鼠皮肤角质层完整、紧附于活性表皮（表皮基底层、棘层、颗粒层和透明层的合 称)之上，角质层经HE染色后呈嗜酸性，沿活性表皮呈带状均匀分布。表皮脊隆起，活性表皮细胞排列 较为紧密。患病裸鼠皮肤切片中，角质层增厚，表皮棘细胞层和基底层也出现明显增厚，真皮层出现单 核细胞浸润。 4.5PCR检测 4.5.1DNA提取 4.5.1.1DNA提取可选用等效的商品化试剂盒或等效的提取方法，下面以TIANGEN"公司的细菌基 因组DNA提取试剂盒（TIANampBacteriaDNAKit）进行DNA提取。 使用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANampBacteriaDNAKit）只是为了叙述方便，并不 1） 代表推荐TIANGEN公司的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。 3