SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4750—2017 猪细环病毒检疫技术规范 Quarantine protocol for swine torque teno sus virus 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4750—2017 #言 前 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院、江西省检验检 疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：杨春华、孙思扬、张强、陈庆富、周延、孙洁、祝建新、罗秋红、花群义、 I SN/T4750—2017 猪细环病毒检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪细环病毒PCR检测法和实时荧光PCR检测法的操作方法。 本标准适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范 3防污染措施 本标准涉及的所有操作应符合GB19489，及SN/T2025的有关规定。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） 4.2 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) 4.3 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) 4.4 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 4.5 RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) 4.6 SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate） 4.7 TTSuV：猪细环病毒（SwineTorqueTenoSusVirus）（参见附录A） 5 设备、材料和试剂 5.1 设备、材料 PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷 冻离心机、1.5mL离心管。 5.2 2试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分子生物学级，试验用水应符合GB/T6682的要求：样品裂解 缓冲液（见B.4）、10%SDS、20g/L蛋白酶K、RNA酶、酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）、异丙醇、70% 乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制）、DEPC水、PCR反应预混液、PCR引物（见B.6）、电泳缓冲液、琼脂 SN/T4750—2017 7.2PCR反应参数 7.2.1TTSuV1a型PCR反应参数 94℃，5min预变性；94℃，30s变性，60℃，30s退火，72℃，2min延伸，35个循环；72℃，5min 延伸。 7.2.2TTSuVk2型PCR反应参数 94℃，5min预变性；94℃，30s变性，62℃，30s退火，72℃，2min延伸，35个循环；72℃，5min 延伸。 7.31.5%琼脂糖凝胶电泳 用电泳缓冲液和琼脂糖配成浓度为1.5%的琼脂糖凝胶。取5μL扩增产物进行电泳，同时设置 DNAMarker，在凝胶成像系统下观察并记录电泳结果。 7.4PCR对照设立 7.4.1[ 阳性对照 以TTSuVla型病毒DNA、TTSuVk2型病毒DNA分别作为TTSuVla检测、TTSuVk2检测的 阳性对照。 7.4.2阴性对照 以不含TTSuV的猪器官组织(或猪血清)DNA作为阴性对照。 7.4.3空白对照 以水作为空白对照。 7.5PCR结果判定 7.5.1PCR阳性对照判定 TTSuV1a型阳性对照，在272bp位置出现目的条带。 TTSuVk2型阳性对照，在226bp位置出现目的条带。 7.5.2阴性对照判定 TTSuV1a型阴性对照，在272bp位置无目的片段条带出现。 TTSuVk2型阴性对照，在226bp位置无目的片段条带出现。 7.5.3空白对照判定 空白对照，无扩增条带出现。 7.5.4 样品结果判定 7.5.4.1阴性 阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正确的条件下： 在272bp位置无目的片段条带出现，表示样品中无TTSuV1a型病毒核酸，表述为TTSuV1a型 3