SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4747.1-2017 进出口食用动物大环内酯类药物残留 量的测定 放射受体分析法 Determination of macrolide residues in live animal for import and exportRadio-receptorassaymethod 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4747.12017 前 言 本部分为SN/T4747系列标准的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：张立怀、陈本龙、柴铭骏、杨超、王万骞、刘洋、黄晨。 SN/T 4747.12017 进出口食用动物大环内酯类药物残留 量的测定放射受体分析法 1范围 SN/T4747的本部分规定了进出口食用动物的血液和尿液中大环内酯类药物残留的检测方法。 本部分适用于进出口食用活动物中大环内酯类药物中红霉素、泰乐菌素、螺旋霉素、林可霉素和替 米考星的药物残留初筛检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6882分析实验室用水规格和试验方法 3方法概述 放射受体分析法是基于药物功能团与微生物受体位点结合，这些位点与某一类抗生素的共有功能 基团相关，应用受体的这种特异性可以实现对某一类抗生素的多残留分析。本方法中，样品残留的大环 内酯类药物经提取、稀释后与[C]标记的红霉素共同竞争结合特异的受体位点，在一定温度下反应后， 离心分离清除未结合的大环内酯类药物，最后加入闪烁液测定["C]衰变发出的β粒子放射性计cpm （countperminute）。测得的cpm值与样品中大环内酯类抗生素残留量成反比关系。 4试剂和材料 4.1大环内酯类抗生素（Charm-Ⅱl测定试剂盒1)（MRLSequentialAssay）"。 4.2阴性对照样品：大环内酯抗生素阴性对照浓缩干粉（MNC).使用时用10mL水溶解，充分摇勾，使 用之前回温至室温。长期贮存需在2℃～6℃。 4.3MSU多抗生素浓缩标准品（MSUMA，为商品化大环内酯类药物残留Charm-II测定试剂盒中自 带）：含有多种大环内酯类抗生素的标准品。使用时用10mL水溶解，充分摇匀，使用之前在冰箱或冰 浴中放置15min。复溶后的标准品含10000ug/kg红素。 4.4MSU提取缓冲液浓缩干粉：用1000mL水溶解，充分摇匀，使用之前回温至室温。可于2℃～ 6℃贮存2个月。 4.5M2缓冲液：使用时取浓缩干粉用50mL水溶解，配制成M2缓冲液，调血清样品pH值用，可于 2℃～6℃贮存2个月。 4.60.1mol/LNaOH，自已配制，调尿液样品pH值用。 4.70.1mol/LHCl，自已配制，调尿液样品pH值用。 4.8闪烁液。 给出该信息是为了方便本部分的使用者.并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有 1） 不同，须经实验评估后采用。 1 SN/T4747.1—2017 4.9 带盖离心管：15mL，50mL。 4.10pH试纸。 4.11 水：符合GB/T6682二级水的规定。 5仪器和设备 5.1 液体闪烁计数仪：CharmⅡ7600分析仪。 5.2 分析天平：感量为0.1g和0.1mg。 5.3 离心机：离心力大于或等于1750g。 5.4 涡旋振荡器。 5.5 微量移液器：10μ100μ，100μ~1000μ1000~5000μ。 5.6 恒温加热器：55℃士1℃。 6分析步骤 6.1试样制备与保存 6.1.1试样制备 6.1.1.1 尿液：新鲜澄清尿液可直接取用，若有杂质需离心去除沉淀物，取上清。 6.1.1.2 血液：全血凝固后取上层血清，避免溶血，若有溶血，可离心后取上清。 6.1.2试样保存 试样可于一18℃以下保存。 6.2# 检测方法 6.2.1阴阳性对照液的配制 6.2.1.1 阴性对照液的配制：取2mLMNC溶液，加人.6mLMSU提取缓冲溶液中混匀，制成阴性对照 液，该对照液可在室温下保存8h。 6.2.1.2阳性对照液的配制：取0.3mLMSUMA多抗标准溶液，加人6mL阴性MNC溶液中混匀，然 125μg/kg的红霉素（对应于4倍稀释的样品，代表样品中500μg/kg红霉素检测量）。该对照液可在室 温下保存8h。 6.2.2样品制备 6.2.2.11 取50ml清洁离心管.并标明标记。 6.2.2.2 尿液样品或血清样品移取2.0mL添加到50mL离心管内。 6.2.2.3吸取2.0mLMNC溶液到离心管中，然后再吸取4.0mLMSU萃取缓冲溶液到离心管，涡旋 振荡2min。 NaOH或0.1mol/LHCI调pH到7.5～8.5；血清样品的pH值应该是7.5.否则要用M2缓冲液调节 pH到7.5。调节pH值时，要尽量控制精准调节，避免加入调节溶液过多影响样品稀释倍数。 6.2.3样品检测 6.2.3.1 根据检测样品的数量及阴阳性对照数，从大环内酯检测试剂盒中取出受体试剂药片，用试剂盒 2 SN/T 4747.12017 中药片压杆平端将受体药片推出到洁净15mL离心管。 长混合时间）。 6.2.3.3加人2mL样品制备液、阴性对照液或阳性对照液到不同的离心管内，每一样品均使用新吸头。 6.2.3.4用涡旋混合器振荡10S，上下来回10次。 6.2.3.5将离心管置于55℃士1℃孵育2min。 6.2.3.6孵育后立即取出离心管，用药片压杆将第二片[11C]标记的红霉素药片加至离心管中，用涡旋 混合器振荡10S，上下来回10次。然后将离心管置于55℃士1℃孵育2min。 6.2.3.7然后将离心管放人离心机中离心力1750g离心5min。离心完成后立即将上清液倒掉，在吸 水纸上将管口残余水分吸干。 6.2.3.8离心管中加人300μL水将沉淀物完全溶解，再加人3mL闪烁液，将离心管盖上，用涡旋混合 器振荡混合。 6.2.3.9将离心管放人液体闪烁计数仪内，在分析仪上进行60S计数，读取["C]频道的cpm值。 6.2.4控制点的确定 6.2.4.1控制点是判断样品阴性与初筛阳性的一个界定值，可根据筛选水平自行设定。 6.2.4.2对于尿液和血清样品，筛选水平红霉素、替米考星为500μg/kg，泰乐菌素、螺旋霉素、林可霉 素为2000μg/kg时，控制点设定步骤：确证为阴性的尿液或血清样品，取6.0mL加0.3mLMUSUMA 多抗生素标准品，混匀后吸取4.0mL转移到另一新离心管中，依次加人4.0mLMNC溶液和8.0ml MSU提取缓冲溶液，混匀并让稀释后的加标样品回至室温。按照6.2.2.4调节加标样品的pH值。做 6个非重复的加标样品，检测其cpm值，将6个结果求平均值，求出cpm平均值乘以系数1.2，即为筛选 水平的控制点。 7结果判定 7.1当样品的cpm值大于控制点时，判定为“阴性”。 7.2当样品的cpm值小于或等于控制点时，应重新测定样品，且同时需要测定阴性对照液和阳性对照 液。当重新测定样品的cpm值大于控制点时.判定为“阴性”；小于或等于控制点时，则判定为“初筛阳 性”，然后需进行确证实验。 8检测限 大环内酯类抗生素检测限见表1。 表1大环内酯类5种抗生素检测限 检测物 检测限/（ug/kg） 红霍素 500 替米考星 500 泰乐南素 2 000 螺旋霖素 2 000 林可综素 2 000