SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4675.30-—2017 出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验 SYBR Green I 荧光 PCR 法 Determination of Zygosaccharomyces bailii from wine for export- SYBRGreenIPCRmethod 2017-12-01实施 2017-05-12发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4675.30—2017 出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验 SYBRGreenI荧光PCR法 1范围 SN/T4675的本部分规定了葡萄酒中拜氏接合酵母（Zygosaccharomycesbailii）的SYBRGreenI 荧光PCR检验方法。 本部分适用于红葡萄酒、白葡萄酒和桃红葡萄酒中拜氏接合酵母的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 拜氏接合酵母 Zygosaccharomycesbaili 拜氏接合酵母属王酵母科（Saccharomycetaceae），接合酵母属（Zygosaccharomyces），营养细胞呈 椭圆形，（3.5μm~6.5um）×（4.5μm~11.5μm）。无运动，以多边出芽无性生殖为主；在25℃~30℃ 条件下，培养3d～7d在营养琼脂培养基上菌落光滑、圆形、呈奶油色或白色，菌落直径2mm～3mm。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniubromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) OD值：光密度值（opticaldensity） 5方法提要 采用SYBRGreenI荧光PCR法进行检验，通过加人反应体系中的SYBRGreenI荧光染料特异性 地掺人新合成的DNA双链后，发射荧光信号，观察荧光PCR仪获取的扩增曲线，判断反应体系中是否 存在特异的DNA靶标，从而对葡萄酒中的拜氏接合酵母进行快速检验。 1 SN/T4675.30—2017 附录B。 35.0<Ct值<40.0，重复一次，如果Ct值仍<40.0，且扩增曲线有明显的指数增长特性，对照结果 正常且熔解曲线正常者，报告检出，否则报告未检出。 Ct值≥40.0，无扩增曲线或者待检样品熔解曲线形态与阳性对照不一致，Tm值不在82℃～84℃ 范围内，对照结果正常，报告未检出。 SN/T 4675.30—2017 附录A （资料性附录） 试剂和材料 A,1 酵母麦芽糖（YM)培养基 A.1.1 成分 3 g 酵母浸粉 麦芽浸粉 3 g 蛋白陈 5 g 葡萄糖 10 g 蒸馏水 1000 mL pH 6.8±0.2 A.1.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，121℃高压灭菌15min，备用。 A.2 山梨醇缓冲液 A.2.1 成分 山梨醇 22 g NaH,PO. 0.27 g Na2 HPO. 1 g 蒸馏水 100 mL A.2.2 制法 先配制0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)：77.4mL0.1mol/LNazHPO4+22.6mL0.1mol/L NaHzPO，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)配制1.2mol/L山梨醇缓冲液。 A.3 CTAB裂解液 A,3.1 成分 20 g CTAB NaCI 81.9 g EDTA 5.8 g Tris 12.1 g 蒸馏水 1000 mL pH 6.8±0.2 A.3.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。 5