SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4397-—2015 出口食品中耗牛源性成分的检测方法 实时荧光 PCR 法 Detection of yak(Bos grunniens)in food products for export- Real-time PCR method 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4397—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈颖、王娉、韩建勋、杨捷琳、黄文胜、吴亚君 H SN/T4397—2015 出口食品中耗牛源性成分的检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了出口食品中耗牛源性成分的实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于肉及肉制品中耗牛源性（九龙耗牛、麦洼耗牛、甘南耗牛、巴州耗牛、斯布耗牛、嘉犁耗 牛、中甸耗牛、天祝白耗牛)成分的定性检测。 本标准所规定方法的最低检出限（LOD)为0.625%（质量分数）。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 耗牛 Bosgrunniens 一种生活在高寒地区的牛属牛亚科动物。 3.2 耗牛源性成分 yak derivedmaterial 耗牛特异性的DNA片段。 3.3 实时荧光 PCRreal-timePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始 模板的定量及定性分析。 3.4 Ct值 cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 4方法提要 探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在耗牛源性成分。 SN/T4397—2015 5试剂和材料 5.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。 5.2耗牛源性成分扩增引物和探针、内参照（真核生物18sRNA.基因)引物和探针详见表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列(5→3") 目的基因 内参照5端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参照3'端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 真核生物18sRNA基因 内参照探针 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMAR 耗牛5'端引物 GACTAATATTCGAAAATCC 耗牛3'端引物 CTCCTAGGAGGGAGCCGAAGTTTCAC 耗牛细胞色素b基因 耗牛探针 FAM-CAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTCCAT-TAMAR 5.3CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris，用 10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。 5.4 TE缓冲液(Tris-HCI、EDTA缓冲液)：10mmol/LTris-HCI(pH8.0)，1mmol/LEDTA（pH8.0)。 5.5 蛋白酶K：20mg/μL。 5.6 RNA酶溶液：5μg/μL。 5.7 Tris饱和酚。 5.8 三氯甲烷。 5.9 异戊醇。 5.10 异丙醇。 5.11 70%乙醇。 5.12 TaqDNA聚合酶。 5.13 dNTP混合液。 5.14 10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2 6 仪器设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2 离心机：最大离心力≥16000g。 6.3 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 冰箱2℃~8℃,-20℃。 6.5 高压灭菌器 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 pH计。 6.8 天平：感量0.01g。 涡旋仪。 6.9 2 SN/T4397—2015 7检测步骤 7.1DNA提取 7.1.1从原始样品中取出部分有代表性的样品，用绞碎机绞碎，充分混匀。称取0.1g经混匀的肉及肉 K，65℃1h，期间每隔10min振荡混匀。 7.1.2加人500μL酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液，体积比为25：24：1；3000r/min涡旋振荡混匀， 12000g离心10min。 7.1.3P 吸取上清液至一新离心管中，加人等体积的异丙醇，振荡混匀，12000g离心10min。 7.1.4 弃去上清液，用预热至65℃TE缓冲溶液溶解DNA。 7.1.5 加人5μLRNA酶溶液，37℃30min。 7.1.6 加人200μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），3000r/min涡旋振荡混匀，12000g离心10min。 7.1.7 吸取上清液至一新离心管中，加人等体积异丙醇，振荡混匀，12000g离心10min。 7.1.8 弃去上清液，70%乙醇洗涤一次，12000g离心10min。 7.1.9 弃去上清液，晾干；加人50μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀。 7.2DNA浓度和纯度的测定 260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1)计算： C=A260XN×50 .(1) 式中： —DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)； A260——260nm处的吸光值； N—核酸稀释倍数。 7.2.2当浓度为10μg/mL~100μg/mL，A250/A28比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。 7.3 实时荧光PCR扩增 7.3.1实时荧光PCR反应体系 反应总体积为25μL，其中含样品DNA（10μg/mL～100μg/mL)2μL，耗牛引物对（10μmol/L）各 1μL，牛探针(5μmol/L)1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL，dNTP(10μmol/L)1μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，用水补齐至总体积25μL。也可采用商品化的PCR扩增体系。真核生物内参照的反应 体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换耗牛引物对和探针。 7.3.2实时荧光PCR反应参数 耗牛特异性引物探针：50℃/2min，95℃10min；40个循环为95℃/15s，57℃/30s。 真核生物引物探针：50℃/2min，95℃10min；40个循环为95℃/15s，60℃/1min。 7.3.3实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以耗牛提取的DNA为阳性对照，以已知不含 有耗牛成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水作为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平 行反应体系。 3 SN/T43972015 8质量控制 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： 空白对照：无荧光对数增长，相应Ct值=40.0； a) b) 阴性对照：无荧光对数增长，相应Ct值=40.0； 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0； c) 内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。 d) 9结果判定及表述 9.1 结果判定 在符合第8章的情况下，被检样品进行检测时： a) 如Ct≤35.0，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录A； b) 如Ct=40.0.则判定为被检样品阴性； c) 如35.0<Ct值<40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为<40.0，则判定被检样品阴性；如 再次扩增后Ct=40.0，则判定为被检样品阴性。 9.2 结果表述 结果可表述如下： a） 结果为阳性者，表述为“检出耗牛源性成分”； b） 结果为阴性时，表述为“未检出耗牛源性成分”。 10 防污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403一2008中附录D的规定执行。 11 安全措施 实验室安全防护按GB19489中的规定进行。 4 SN/T4397—2015 附录A （资料性附录） 耗牛源性成分的基因扩增靶标参考序列 catcatggtgaaacttcggctccctcctaggag 5