SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4394--2015 出口食品中红木素和隆红木素的测定 液相色谱法 Determination of bixin and norbixin in foods for export--LC method 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4394—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：钱疆、陈健、刘正才、黄杰、陈章捷、赵建晖、杨方、张玉燕、薛方财。 SN/T4394--2015 出口食品中红木素和降红木素的测定 液相色谱法 1范围 本标准规定了出口食品中红木素和降红木素含量测定的液相色谱方法。 本标准适用于奶酪、麦片、方便面、焙烤食品、饮料、火腿肠、复合调味料、巧克力、膨化食品中红木素 和降红木素的定量测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 试样中红木素和降红木素采用氨水乙醇溶液提取，经石油醚脱脂，乙酸酸化后采用二氯甲烷反提 取，提取液浓缩后，采用反相色谱柱分离.液相色谱紫外可见分光光度测定，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1无水乙醇：色谱纯。 4.2氨水，浓度含量为25%~28% 4.32 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（简称BHT） 4.4 硅藻土，商品名为Celite545或者相当产品。 4.5石油醚：30℃~60℃沸程。 4.6 冰乙酸，浓度≥99%。 4.7二氯甲烷，色谱纯。 4.8 乙腈，色谱纯。 4.9日 甲醇，色谱纯。 4.10 提取液：量取50mL氨水（4.2)与950mL无水乙醇（4.1），混匀，加人1gBHT（4.3），振荡溶解。 4.11 含0.1%BHT的甲醇溶液，称取0.5gBHT，用500mL甲醇（4.9)溶解。 4.12 含0.1%BHT的乙醇溶液：称取0.5gBHT，用500mL无水乙醇溶解。 4.13 70%乙腈溶液：量取350mL乙腈（4.8）和150mL去离子水，混合均匀，加人0.5gBHT，振荡 溶解。 4.14除脂液：称取0.5gBHT，用500mL石油醚（4.5）溶解。 4.15 反提取溶液：取0.5gBHT，用500mL二氯甲烷（4.7)溶解。 4.16 标准物质：顺式构型红木素和顺式降红木素标准物质，纯度≥98.0%，标准物质信息参见表A.1。 SN/T4394—2015 4.17标准储备液：准确称取经折算含量的降红木素和红木素标准物质（4.16）10.0mg于100mL棕色 容量瓶，分别用甲醇溶液（4.11)和乙醇溶液（4.12）配制成浓度为100μg/mL的标准储备溶液。该溶液 一18℃下避光保存，有效期6个月。 4.18标准工作溶液：取标准储备液（4.17），用乙腈溶液（4.13）稀释成0.50μg/mL、1.00μg/mL、 2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL的标准工作液。 4.19含顺、反构型混合溶液的制备：各取5.0mL的红木素和降红木素的储备液（4.17），用无水乙醇 （4.1)稀释定容于50mL无色透明容量瓶中，置于阳光下直射2h，获得含有顺反构型的混合溶液。混 合构型的色谱保留参见图B.2。此混合溶液一18℃下避光保存，有效期15天。 5仪器和设备 5.1液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或多波长紫外光可见光检测器。 5.2具塞塑料离心管：50mL容积。 5.3电子天平：感量分别为0.01g、0.001g。 5.4涡旋混匀器，转速可达3000r/min。 5.51 低速离心机：转速可达3000r/min。 5.6 棕色鸡心浓缩瓶，150mL容积。 5.7 旋转蒸发浓缩仪。 5.8木 棕色容量瓶或者带棕色刻度试管，5.00mL。 6测定步骤 6.1提取 6.1.1麦片、方便面、焙烤食品、复合调味料、膨化食品 称取试样5g（精确到0.01g）于50mL离心管中（5.2），加人20mL提取液（4.10），3000r/min涡 旋振荡2min，3000r/min低速离心，转移上清液于150mL棕色鸡心浓缩瓶（5.6），重复提取两次，合并 提取液至鸡心浓缩瓶，40℃下采用旋转蒸发仪浓缩至体积5mL左右，样液转移到另一支50mL塑料 离心管内，加人1mL氨水（4.2），5mL去离子水，5mL含0.1%BHT.的乙醇溶液（4.12），加人除脂液 （4.14)20mL，涡旋振荡1min，离心弃去上层溶液，重复除脂一次。下层溶液加入2mL冰乙酸（4.6）， 采用25mL反提取溶液（4.15)反萃取，离心后将下层二氯甲烷溶液转移到鸡心浓缩瓶，加人1mL含 0.1%BHT的乙醇溶液（4.12），35℃浓缩至体积约1mL～2mL，转移残留溶液到5mL棕色容量瓶或 刻度试管（5.8），用少量多次0.1%BHT的乙醇溶液清洗鸡心浓缩瓶，合并定容到5.00mL，过滤膜上机 分析。 注1：前处理过程要注意避光。 注2：旋转蒸发过程样液不要蒸干。 6.1.2奶酪、火腿肠、巧克力等黏稠状样品 土充分混匀，搅拌至疏松颗粒状，加人20mL提取液，以下步骤同6.1.1“3000r/min涡旋振荡 2min...过滤膜上机分析"操作。 6.1.3饮料样品 称取5g（精确到0.01g）样品于50mL塑料离心管，加人5mL含0.1%BHT的乙醇溶液，2mL氨 2 SN/T 4394—2015 水，补充水至20mL，加人除脂液20mL，涡旋振荡1min，离心弃去上层溶液，重复除脂一次。以下步 6.2测定 6.2.1液相色谱参考条件 6.2.1.1 色谱柱：C18色谱柱，250mm×4.6mm（内径），粒径5μm，或相当者。 6.2.1.2 流动相：乙睛：水=75：25（体积比，含2%体积比的乙酸）。 6.2.1.3 流速：1.0mL/min。 6.2.1.4 柱温：室温。 6.2.1.5 进样量：20μL。 6.2.1.6 检测波长：458nm。 6.2.2 标准曲线的绘制 将4.18配制的标准工作溶液，按浓度由低到高的顺序进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准 曲线。 6.2.3定性测定 按照上述6.2.1条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的目标物的色谱峰保留时间与标准工 作溶液一致（变化范围在士2.5%之内），并且样品中分析物光谱满足下列条件：最大吸收波长与校正标 准相同，样品与标准品光谱任何一点的差别不大于10%吸光率，使用计算机匹配时两者光谱数据应超 过临界匹配因子，则可判定样品中存在待测物。 注：反式结构的红木素和降红木素的保留时间由4.19混合构型标准溶液上机确定。 6.2.4定量测定 用标准工作曲线按外标法定量，标准工作液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。 超过线性应适当稀释样液，在上述色谱条件下顺式红木素和顺式降红木素的色谱图参见图B.1。 注：反式结构的响应值按对应顺式结构曲线计算，顺反构型结果合并计算。 7结果计算和表达 结果用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中被测组分的含量，计算结果需扣除空白值结果并保留 三位有效数字。 ..（1) As:Xm×1000 式中： X, 试样中红木素或降红木素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； A；样液中红木素或降红木素组分的峰面积； 标准工作溶液中红木素或降红木素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）; Asi— 标准工作溶液中红木素或降红木素的蜂面积； m 最终样液代表的试样量，单位为克（g）。