SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4348—2015 螯虾瘟检疫技术规范 Quarantineprotocolforcrayfishplague 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4348—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准修改采用世界动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册》（2014年版）的2.2.1，主要修改 如下： 原文格式及内容顺序排版上作了调整，按照GB/T1.1--2009进行编写； 原文中“Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A； 删除了原文“4.2.Clinicalmethods”内容； 原文4.3.1.2.3.1.普通PCR上游引物（B042)序列为5-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT- CF-3'。该引物序列3'末端有误。经与OIE参考实验室专家确认，正确的引物序列为5" GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3'; 增加了实时荧光PCR方法Ct阅值的描述； -对原文“7.Corroborativediagnosticcriteria”的表述形式进行了调整。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：贾鹏、史秀杰、王津津、于力、郑晓聪、何俊强、兰文升、刘、陈兵、王红英、 叶奕优。 H SN/T4348—2015 螯虾瘟检疫技术规范 1范围 本标准规定了螯虾瘟的临床症状、病原分离、普通PCR和实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于螯虾瘟的诊断、流行病学调查和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3概述 物传染性疾病。A，astaci属于藻界（Chromista）、卵菌门（Oomycota）、卵菌纲（()omycetes）、硅藻和褐 藻类（Diatoms和Brownalgac）。根据A.aslaci对宿主的易感程度，检疫对象分为北美螯虾和高度易 感螯虾两大类。北美螯虾是指野生或养殖于北美地区的所有种类螯虾，是A.astaci的自然携带者，被 感染后通常无临床症状或死亡。高度易感螯虾是指除北美螯虾外，对A，astaci易感且易出现临床症状 或死亡的螯虾（参见附录A）。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ITS：核糖体DNA内转录间隔区（internaltranscribedspacer） ITS1：核糖体DNA内转录间隔区1(internaltranscribedspacer1） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainrcaction） CTAB：十六烷基三甲基溴化胺（cetyltrimethylammoniumbromide) UNG：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase） Ct：循环阅值（cyclethreshold） 5 仪器和设备 5.1倒置显微镜。 5.2冷冻离心机。 5.3微量移液器。 5.4PCR扩增仪。 1 SN/T4348—2015 5.5 实时荧光PCR仪。 5.67 水平电泳仪。 5.7凝胶成像仪。 5.8超净工作台。 5.9 恒温培养箱。 5.10 二级生物安全柜。 6 试剂和材料 水：符合GB/T6682中一级水的规格。 6.2螯虾瘟菌株：由指定单位提供。 6.3无水乙醇，分析纯，使用前预冷至一20℃。 6.470%乙醇。 6.5DNA聚合酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 6.6dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP。 6.7 螯虾瘟普通PCR检测引物BO42/BO640： 上游引I物 B0 42:5'-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3'; 下游引物B0640:5-CTATCC-GAC-TCC-GCA-TTC-TG-3； 扩增A.astaciITS基因中大小为569bp片段。 6.8螯虾瘟普通PCR复核引物TS1/TS4： 上游引物TS1:5'-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3'； 扩增A.astaciITS基因中大小为757bp片段。 6.9实时荧光PCR引物及探针： 上游引物AphAstITS-39F:5"-AAG-GCT-TGT-GCT-GGG-ATG-TT-3'; -下游引物AphAstITS-97R:5'-CTT-CTT-GCG-AAA-CCT-TCT-GCT-A-3'; 探针:AphAstITS-60T:5'-6-FAM-TTC-GGG-ACG-ACC-CMG-BNF-Q-3'; 扩增A.astaciITS1基因中大小为59bp的片段。 7临床症状 高度易感螯虾感染A.astaci后，失去正常厌光性，独自游动，失去平衡，腹部朝上且不易翻转。病 虾透明软角质层下肌肉组织有白色和棕色坏死斑点，发病初期前腹部和足关节处变白。有时可见局部 透明软表皮和肌肉组织有褐色黑化病灶，在病灶表皮上可见棕色菌丝向外延伸。 北美螯虾感染A.astaci后，有时在其软角质层可见黑化病灶，但通常没有明显临床症状。 8采样 样品包括活的、濒死的或死亡不超过24h的螯虾，采样数量按照GB/T18088规定执行，实验室检 测条件应符合GB19489的规定。 在运送活样品时，需将样品置于通气、潮湿且温度低于16℃的容器中，24h内送达实验室。对于 濒死的或24h内无法送达的样品，将其冷冻运输至实验室，待解冻后取靶器官组织，或将样品按体积比 1：10固定于乙醇溶液（浓度高于70%）后送检，但只能用于普通PCR和实时荧光PCR方法检测。高 2 SN/T4348—2015 度易感螯虾取其腹部软角质层，北美螯虾取其腹部角质层、腹足和尾节。 9诊断方法 9.1病原分离 9.1.1病原培养 无菌条件下，用蘸有无菌水的棉签或滤纸小心擦拭螯虾腹部软组织或其他可能被污染的部位。用 无菌手术刀将易感部位、病灶的肌肉组织或角质层横切下来，置于含有双蒸水的培养皿中轻轻漂洗后， 将其切成3mm²～5mm的小块，置于IM培养基（见附录B中B.1)表面，用封口膜密封后置于16℃～ 24℃培养并逐日观察。 9.1.2孢子囊、初级游走孢子和次级游走孢子的诱导 无菌条件下，取9.1.1中带有生长活力菌丝的一小团琼脂（直径约3mm～4mm），置于含有30mL 9.1.3结果判定 若观察到孢子囊、初级游走孢子或次级游走孢子，判定病原分离方法检测结果为阳性。 9.2普通PCR方法 9.2.1设立对照 从提取DNA开始，每个步骤均需设立阳性对照、阴性对照、空白对照。取已知含有A.astaci的样 品作为阳性对照，取已知无A.astaci的样品作为阴性对照，取等体积的水作为空白对照。 9.2.2核酸抽提 螯虾组织和培养后的菌丝均可用于核酸提取。 直接从螯虾组织中提取DNA核酸。无菌条件下，用蘸有无菌水的棉签清洗螯虾体表，取螯虾易感 组织30mg～50mg，置于液氮研磨成粉状。将样品转入2mL离心管，加人900μLCTAB（见B.3），上 下颠倒混匀，25℃作用2h。加入600μL抽提液I（见B.4），振荡混匀1min。12000r/min离心 5min。取上层水相于新的离心管，加人700μL抽提液Ⅱ（见B.5），上下颠倒混匀，12000r/min离心 5min。取上层水相于新的离心管，加人1.5倍体积的预冷无水乙醇，上下颠倒混匀。一20℃沉淀2h 或更长时间，12000r/min离心10min。弃上清液，于沉淀中加人75%乙醇溶液800μL，漂洗沉淀， 12000r/min离心5.min。弃上清液，将离心管倒置于滤纸上，室温干燥30min。向DNA沉淀中加 50μLTE缓冲液（见B.6），一20℃保存备用。 从培养后的菌丝中提取DNA核酸。无菌条件下，从琼脂培养基表面刮取少量菌丝，无需使用液氮 研磨，直接抽提核酸，步骤同上。 在实验过程中，可采用蛋白酶K消化裂解法或其他同等效果的商业化DNA抽提试剂盒代替以上 方法。 9.2.3反应体系 普通PCR方法包括2对特异性引物，分别为BO42/B0640和TS1/TS4。其中，普通PCR检测首 选B042/B0640引物，TS1/TS4引物仅用于阳性结果复核。 3 SN/T43482015 BO42/BO640引物和TS1/TS4引物的PCR反应体系相同。10×PCR缓冲液5μL，MgCl2 (25mmol/L)3μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmoL/L）2.5μL，下游引物（10μmol/L） PCR扩增仪。 9.2.4反应条件 9.2.4.1使用B042/B0640引物时，普通PCR反应条件为94℃预变性2min;94℃变性1min，59℃ 退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；72℃再延伸7min；4℃保存。 9.2.4.2使用TS1/TS4引物时，普通PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性1min，55℃退火 1min，72℃延伸1min，共40个循环；72℃再延伸7min;4℃保存。 9.2.5琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液（见B.7)配制1.5%的琼脂糖（含0.5μg/mL溴乙啶，见