SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4346.8—2015 国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫 技术规范第8部分：实验室检测 Technical specification for health quarantine to the fulminating and highly fatal contagious diseases at frontier ports--Part 8 :Laboratory detection 2016-07-01实施 2015-12-04发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4346.8—2015 前言 SN/T4346《国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范》分为10个部分： 第1部分：总则； 第2部分：风险评估与预警； 第3部分：风险交流； 第4部分：交通工具、货物及集装箱卫生检疫查验； 一第5部分：人员及行李卫生检疫查验； 第6部分：境外病例转运专用包机卫生检疫； 第7部分：卫生处理； 第8部分：实验室检测； 第9部分：个人防护； 第10部分：保障。 本部分为SN/T4346的第8部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院 本部分主要起草人：李小波、林燕如、肖利力、黄吉城、孙肖红、郑夔、师永霞、冯庆文、袁帅、毕英杰。 I SN/T 4346.82015 国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫 技术规范第8部分：实验室检测 1范围 SN/T4346的本部分规定了国境口岸入出境人员以接触传播为主要传播途径的烈性传染病实验 室检测。实验室检测流程包括样本采集、处理，实验室检验程序、方法，结果判定及相关的生物安全 要求。 本部分适用于口岸入出境人员烈性接触性传染病实验室检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1439国境口岸埃博拉病毒分子生物学检测方法 SN/T3558马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法 SN/T4346.9国境口岸烈性接触性传染病卫生检疫技术规范第9部分：个人防护 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（(PCR)技术的应用 人间传染的病原微生物名录卫生部 3实验室资质要求 进行本标准规定的烈性接触性传染病检测的实验室须为通过国家CNAS认可并获得国家卫生和 计划生育委员会实验活动资质认定的生物安全三级实验室。实验室生物安全应符合GB19489相关规 定；聚合酶链反应（PCR)防污染措施按照WS/T230执行。 4检测对象 人出境口岸疑似感染埃博拉出血热、马尔堡出血热等烈性接触性传染病的人员。 5样本采集、处理 5.1由于烈性接触性传染病传染风险大，样本采集过程存在很大的生物安全风险，一般以采集患者血 样为主，采样过程中应做好个人生物安全防护。一般发病14d内，可在患者血样中检测到病毒核酸和 抗原；发病10d～14d后的血样中可检出特异性抗体。 5.2血液样本采集：静脉采集疑似病人抗凝全血5mL。样本采集、运送人员应严格按照相关规定做好 个人生物安全防护，所有使用过的消耗品均须进行严格的消毒灭菌处理。 1 SN/T 4346.8—2015 5.3 3血液样本保存、运输：样本采集后，应于4℃以下生物安全送样箱中尽快送到有资质的实验室检 测，或一70℃以下保存待检。样本保存、运输过程中须严格按照国家高致病性菌、毒种相关规定进行， 个人生物安全防护详见SN/T4346.9。 6检测方法 6.1 分子生物学检测 6.1.1适用样本范围 适用于人全血样本中烈性接触性传染病病原体核酸的检测。 6.1.2主要仪器和设备 下列仪器和设备适用于本部分： 生物安全柜； 高压灭菌器； 普通冰箱； —水浴锅或金属浴； 一冷冻离心机（带密封的离心安全杯，转速可达20000g）； 一实时荧光PCR仪。 6.1.3主要试剂 下列试剂适用于本部分： 核酸提取试剂：使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒QIAampViralRNAMiniKit!"，详见 说明书； 步荧光RT-PCR反应体系构建使用AMBION公司的AgPath-IDTMOne-stepRT-PCR Kit"试剂盒进行； TRIZOL试剂。 6.1.4血液样本处理 在具备检测活动资质的实验室生物安全柜内，取100μL全血样本与1mLTRIZOL试剂轻柔颠倒 混合（1：10比例），室温放置10min备用，此操作过程应尽量轻柔，严格控制生物气溶胶的产生。 6.1.5 RNA提取 6.1.5.1采用QIAGEN公司的病毒RNA提取试剂盒以QIAampViralRNAMiniKit，德国QIAGEN 公司产品为例"，内含AVL、AW1、AW2、AVE等成分。 6.1.5.2取上述作用后的标本140μL加人560μL裂解缓冲液（Lysisbuffer，AVL），在旋涡混合器上 振荡15s混匀，室温静置10min。 6.1.5.3加人560μL无水乙醇终止反应，在旋涡混合器上振荡15s混匀。 6.1.5.4 裂解后的液体分两次移入管柱，每次6000g离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的 膜上。 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 SN/T4346.82015 6.1.5.5加500μL洗液（AW1)至管柱上，6000g离心1min，弃去AW1。 6.1.5.6加500μL洗液（AW2)至管柱上，20000g离心3min，弃去AW2，进一步20000g离心1min 以彻底去除残留在膜上的乙醇。 6.1.5.7加人60μL洗脱液（AVE），室温静置1min。 6.1.5.8将管柱置于1.5mL离心管上，温度4℃，6000g离心1min，得到的RNA即可进行实时荧光 RT-PCR检测。 6.1.6 6实时荧光PCR检测 埃博拉病毒核酸检测按照SN/T1439执行。 马尔堡病毒核酸检测按照SN/T3558执行。 其他病毒检测参照相应的标准执行。 6.2 血清学检测 6.2.1双抗体夹心法ELISA检测核蛋白抗原 6.2.1.1适用样本范围 适用于人血清样本中烈性接触性传染病病原体核蛋白抗原的检测。 6.2.1.2 主要仪器和设备 下列仪器和设备适用于本部分： 恒温培养箱； 含波长450nm的酶标仪； 洗板机； 移液器。 6.2.1.3主要试剂 双抗体夹心法ELISA抗原检测试剂盒。 6.2.1.4 样本处理 血清样本60℃灭活1h后，置于生物安全三级实验室核心工作区生物安全柜内。在洗板机废液收 集桶内加人含10%有效氯的消毒剂，加人量为废液桶总体积的5%。 6.2.1.5 操作步骤 操作步骤如下（具体参照试剂盒说明书进行）： a) 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30min，使用前将试剂轻轻震荡混匀。 b) 配液：将新鲜配制的洗液注人洗板机的洗液桶内。 c) 编号：将样本对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，模拟阳性对照2孔和空白对照1孔。 (P 加稀释液：每孔加稀释液20μL，空白孔除外。 e) 加样：分别在相应孔中加人待测样本或阴阳性对照各100μL，空白孔除外。 f) 温育：用封板膜封板后，置37℃温育60min。 加酶：每孔加酶标试剂50μL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。 g) h) 温育：用封板膜封板后，置37℃温育30min。 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍。 3 SN/T4346.8—2015 j) 显色：每孔加人显色剂A、显示剂B各50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色30min。 测定：每孔加终止液50μL，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波 长450nm/600nm～650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。 1) 清洗、消毒洗板机：按洗板机内置程序分别采用蒸馏水、20%乙醇和75%乙醇进行清洗消毒， 30min后，再用蒸馏水清洗。 6.2.1.6 结果判定 阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1。 阳性对照的正常值范围：A≥0.50。 阳性判定：样品A值≥临界值者为病毒抗原阳性。 阴性判定：样品A值<临界值者为病毒抗原阴性。 6.2.2抗体捕捉法ELISA检测IgM抗体 6.2.2.1 适用样本范围 适用于人血清样本中烈性接触性传染病病原体的IgM抗体检测。 6.2.2.2 2主要仪器和设备 下列仪器和设备适用于本部分： 恒温培养箱； -含波长450nm的酶标仪； 洗板机； 移液器。 6.2.2.3 3主要试剂 抗体捕捉法IgM抗体检测试剂盒。 6.2.2.4样本处理 血清样本60℃灭活60min后，置于生物安全三级实验室核心工作区生物安全柜内。 在洗板机废液收集桶内加人含10%有效氯的消毒剂，加人量为废液桶总体积的5%。 6.2.2.5操作步骤 操作步骤如下（具体参照试剂盒说明书进行）： a） 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30min，使用前将试剂轻轻震荡混匀。 b) 配液：将新鲜配制的洗液注入洗板机的洗液桶内 c) 加稀释液：每孔加人样本稀释液100uL，空白及阴阳性对照孔除外。 (P 加样：在相应孔中加人待测样本10μL，轻轻振荡混匀，阴、阳性对照加100μL。 e) 温育：用封板膜封板