SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4299—2015 猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范 Quarantineprotocolforteschovirus encephalomyelitis 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4299—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参照国际动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）（Manualof DiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals，2012）中2.8.10规定的主要诊断技术编制。两 者的主要差异如下： 本标准未采用2.8.10提出的聚合酶链式反应。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫 局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张强、熊炜、王巧全、李树清、李健、张志灯、杨春华、王艳、蒋静、林颖峰、吴绍强、 张永宁。 SN/T4299—2015 猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范 范围 1 本标准规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验 和酶联免疫吸附试验的技术规范。 本标准适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和分析方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE细胞病变 ELISA 酶联免疫吸附试验 EDTA 乙二胺四乙酸 FITC 异硫氰酸盐荧光素 IBRS-2 猪肾细胞系 OD值 光密度值 PBS 磷酸盐缓冲液 PK15 猪肾细胞系 PTV 猪捷申病毒 ST 猪睾丸细胞系 TCIDso 组织培养半数感染量 Tris 三羟甲基氨基甲烷 临床诊断 4 4.1 临床症状 临床症状主要表现为神经性症状，分急性和亚急性，参见附录A中A.1。 4.2 病理变化 主要病变出现在神经组织，参见A.2。 SN/T 4299—2015 4.3 流行病学 不同年龄、品种的家猪和野猪均易感，参见A.3。 4.4 初步诊断 根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步确诊应采集样品进行实验室检测。 5实验室诊断 5.1设备、材料和试剂 本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 5.1.1 PTV标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。 5.1.2 细胞：PK15、IBRS-2、ST细胞系。 5.1.3 胎牛血清：56℃水浴灭活30min。 5.1.4 细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS(0.01mo1/LpH7.4)缓冲液、病毒培养液：见附录B。 5.1.5 FITC标记的免抗猪IgG：购买商品化试剂，按说明书稀释。 5.1.6 0.01%伊文斯蓝：见附录B。 5.1.7 0.1mol/LpH8.6的Tris甘油缓冲液：见附录B。 5.1.8 0.01mol/LpH7.4TEN的缓冲液：见附录B。 5.1.9 辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。 5.1.10 封闭液、底物液、稀释液、终止液：见附录B。 5.1.11 生物安全柜。 5.1.12 倒置显微镜。 5.1.13 荧光显微镜。 5.1.14 37℃恒温培养箱。 5.1.15 二氧化碳培养箱。 5.1.16 微量移液器 5.1.17 高速冷冻离心机。 5.1.18 超速离心机。 5.1.19 洗板机。 5.1.20 酶标仪。 5.2 采样 5.2.1 采样标准 按GB/T18088规定采样。 涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求 进行。 5.2.2病料的采集 将发病猪扑杀，无菌采集病猪的脑和脊髓。疑似病例，也可采集粪便样品。不能立即鉴定的样品， 需保存于pH7.4磷酸甘油缓冲液（等体积的0.01mol/LpH7.4PBS和甘油）中。 2 SN/T 4299—2015 5.2.3血样的采集制备 无菌采集动物血，每头不少于5mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封，做好标示后冷藏 保存。 5.3病毒分离 5.3.1病料处理 5.3.1.1称取1g组织块，切碎，研磨，用PBS(0.01mol/LpH7.4)制成质量分数为10%的悬液；粪便 样品取0.1g固体粪便或0.1mL液体粪便，再加人1mLPBS，置于涡旋振荡器混匀。 5.3.1.2样品悬液800g转速离心10min。 5.3.1.3每毫升上清液加人100IU青霉素和100mg链霉素，4℃放置12h。 5.3.1.4上清液用于接种单层细胞培养物，粪便样品上清液做梯度稀释后接种细胞；无菌血清样品可直 接接种单层细胞培养物。 5.3.2操作步骤 长满单层细胞的25cm²细胞培养瓶弃去生长培养基，在细胞瓶内接入1mL可疑组织上清液；接 持液；置37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察CPE，连续观察3d～4d，若无CPE，则收取培养物，反复 冻融3次后接种到长满单层的细胞上，盲传3代。出现CPE，收取培养物，一70℃以下保存待鉴定。粪 便样品接种24h内出现细胞死亡，可能由于粪便的毒性作用所致。试验同时设未接种样品的细胞 对照。 5.3.3结果判定 5.3.3.1对照细胞正常，接种样品的细胞盲传3代后无CPE，判为阴性 5.3.3.2初期出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，CPE增多，所有细胞脱壁。经 过连续传代后，病毒生长良好，可在24h～48h后产生完全的CPE， 5.3.3.3出现上述典型CPE的培养物，可用病毒中和试验或间接免疫荧光试验进一步鉴定血清型。 5.4病毒中和试验 5.4.1操作步骤 从细胞培养物中收获的分离物用维持液从10-1到10-作10倍梯度稀释。若鉴定捷申病毒血清 型，每个梯度都要有对应的血清型，则需要加12列。50μL1：10稀释的PTV-1～PTV-11型标准阳性 血清依次加到1列～11列孔内，50μL标准阴性血清加到最后一列。振荡混匀后混合物置4℃反应过 夜或37℃反应1h，随后转人长满单层培养物的微孔板孔内。接种后细胞置37℃二氧化碳培养箱继续 培养。72h后开始观察CPE，其后每天1次，根据CPE出现情况，一直观察10d。 5.4.2结果判定 如果分离物在PTV-1型标准阳性血清对应列的滴度比阴性血清列低10°以上，就可判定该分离病 毒属于PTV-1，依此类推。 3 SN/T4299—2015 5.5间接荧光抗体试验 5.5.1操作步骤 5.5.1.1 把可疑分离物接种在长满单层细胞的多孔载玻片上。同时进行阴、阳性样品对照试验， 5.5.1.237℃5%COz培养箱培养12h16h后将细胞玻片取出，用PBS(0.01mol/LpH7.4）冲洗 3次，冷丙酮固定5min~15min。 5.5.1.3将细胞玻片放人湿盒内，加入用PBS(0.01mol/LpH7.4)1：10稀释的PTV标准阳性血清。 5.5.1.4盖好湿盒，置37℃孵育60min。 标记兔抗猪荧光抗体。置37℃孵育30min。 5.5.1.6细胞玻片用PBS(0.01mol/LpH7.4)冲洗3次，风干，用0.1mol/LpH8.6的Tris甘油缓冲 液封片。 5.5.2判定标准 细胞玻片经处理后，用荧光显微镜检查，阳性对照在细胞浆中和细胞核外周出现特异性黄绿色荧 光，阴性对照无荧光，则试验成立。受检样本检出黄绿色荧光，可判为阳性；否则，判为阴性， 5.6微量血清中和试验 5.6.1操作步骤 5.6.1.1将血清置56℃水浴中灭活30min。 5.6.1.2用细胞培养液将待检血清在96孔平底微量细胞培养板中从1：2开始作倍比稀释，稀释至 5.6.1.3用细胞培养液预先将原种病毒稀释成100TCIDso/50μL工作液，每孔加50μL，振荡混匀。 5.6.1.4微量板加盖，37℃孵育1h，剩余病毒（稀释好而未用完的100TCIDso/50μL病毒）同样置 37℃孵育1h。 5.6.1.5 病毒回归滴定，将剩余病毒作4个10倍系列稀释（10-110-*），每稀释度加4孔，每孔加 50μL。 5.6.1.64 每孔加50μL细胞悬液（细胞浓度为5×105/mL）。 5.6.1.7将微量板振荡摇匀后密封，置37℃二氧化碳培养箱中培养2d～8d。 5.6.2结果判定 5.6.2.1用倒置显微镜观察到微量板孔中出现特征性CPE，且病毒回归滴定结果在30TCIDso～ 300TCIDso之间，标准阳性血清滴度与原测定滴度相差在0.3log10单位以内，阴性对照血清在最低稀 释（1：2)时无中和效价，不加病毒的细胞孔正常，则试验成立。 5.6.2.2按照Spearman-Karber法计算待检血清中和50%病毒的稀释度，如果对应的血清中和病毒的 稀释度在1：8或更高，则判为阳性。 5.7酶联免疫吸附试验（ELISA) 5.7.1抗原制备 5.7.1.1用细胞增殖病毒，同时用未接毒的细胞做阴性对照抗原。 5.7.1.2收毒，反复冻融3次，200g离心15min，取上清液，加50%饱和硫酸铵，4℃沉淀120min。未 4 SN/T 4299—20