SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4262-2015 出口乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸和 对羟基苯甲酸酯类防腐剂的测定 高效液相色谱法 Determination of benzoic acid,sorbic acid and p-hydroxybenzoic acid esters antiseptics in milk and dairy products for export---HPLC Method 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 层支真伪 SN/T4262—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、重庆出人境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：陈冬东、王俊苏、周超、马萍、郑小玲、代汉慧。 I SN/T4262—2015 出口乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸和 对羟基苯甲酸酯类防腐剂的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了乳及乳制品中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸 丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯的测定方法。 本标准适用于牛奶、酸奶、奶粉及乳酪中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对 羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯的测定。 2方法提要 试样经甲醇提取，用亚铁氰化钾-乙酸锌沉淀蛋白质，取上清液供液相色谱检测，外标法定量。 3试剂和材料 除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水或相当纯度的水。 3.1甲醇：HPLC级。 3.2盐酸。 3.3乙酸铵。 乙酸锌。 3.5 亚铁氰化钾。 盐酸溶液（1mol/L）：取90mL盐酸加水定容至1000mL。 3.7 乙酸锌溶液（219g/L）：称取乙酸锌219g，加水定容至1000mL。 3.8亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取亚铁氰化钾106g，加水定容至1000mL。 3.90.02mol/L乙酸铵溶液：称取1.54g乙酸铵定溶于1L水中。 3.10 ）苯甲酸标准品（Benzoicacid，CAS号65-85-0）：纯度大于等于99%。 3.11山梨酸标准品（Sorbicacid，CAS号110-44-1）：纯度大于等于99%。 3.12对羟基苯甲酸甲酯标准品（4-Hydroxybenzoicacid-methylester，CAS号99-76-3）：纯度大于等 于99%。 3.13对羟基苯甲酸乙酯标准品（4-Hydroxybenzoicacid-ethylester，CAS号120-47-8）：纯度大于等 于99%。 3.14对羟基苯甲酸丙酯标准品（4-Hydroxybenzoicacid-propylester，CAS号94-13-3）：纯度大于等 于99%。 3.15对羟基苯甲酸丁酯标准品（4-Hydroxybenzoicacid-n-butylester，CAS号94-26-8）：纯度大于等 于99%。 3.16对羟基苯甲酸异丁酯标准品（4-Hydroxybenzoicacid-iso-butylester，CAS号4247-02-3）：纯度大 于等于99%。 1 SN/T4262—2015 3.17标准储备液：准确称取适量上述标准品，分别用甲醇配制成浓度为1000μg/mL的标准储备液， 0℃～4℃避光保存。 3.180.45μm微孔滤膜：有机系。 41 仪器和设备 4.1 液相色谱仪，配可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器。 4.2天平：感量为0.1mg，0.01g。 4.3旋涡混匀器。 4.4 超声萃取仪。 5试样的保存 乳及乳制品试样于0℃～4℃冰箱内保存 样品保存过程中，应防止样品受到污染， 6测定步骤 6.1提取 6.1.1液态试样 称取5g试样（精确至0.01g）于25mI离心管中，加人1mL盐酸溶液（3.5），20mL甲醇，超声提 取20min后，加入1mL乙酸锌溶液（3.6）和1mL亚铁氰化钾溶液（37），用甲醇定容至25mL，静置分 层，取上清液过0.45μm微孔滤膜（3.17），待液相色谱仪测定。 6.1.2固态试样 称取5g试样（精确至0.01g）于25mL离心管中，加人10mL水，充分混匀，加人1mL盐酸溶液， 10mL甲醇，超声提取20min后，加人mL乙酸锌溶液和1mL亚铁氰化钾溶液，用甲醇定容至 25mL，静置分层，取上清液过0.45μm微孔滤膜，待液相色谱仪测定， 6.2测定 6.2.1 液相色谱条件 液相色谱条件参考如下： a) 液相色谱仪，配可变波长紫外检测器或二极管阵列检测器； b) 色谱柱：C1柱250mm×4.6mm（内径），5μm，或相当者； c) 流动相：甲醇：0.02mol/L乙酸铵溶液，梯度程序参见附录A表A.1； (P 检测波长：参见附录A表A.2： e) 进样量：20μL； 柱温：25℃； f) g) 流速：1.0mL/min。 6.2.2 定性、定量测定 按照步骤6.2.1液相色谱条件测定样液和标准工作溶液，外标标准曲线法测定样液中苯甲酸、山梨 2 SN/T4262—2015 酯的残留量。样品中待测物苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙 酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯残留量应在标准曲线范围之内，如果残留量超出标准曲线 范围，应用甲醇进行适当稀释。在上述色谱条件下，对混合标准工作溶液和样液等体积参插进行测定， 苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基 苯甲酸异丁酯的参考保留时间依次为4.5min、5.4min、12.9min、15.8min、17.3min、19.2min、 19.5min，标准品的色谱图参见附录B中的图B.1。 6.2.3空白试验 空白试验，除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。 7结果计算和表述 用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（1）计算样品中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲 酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯的含量。 CXVX1000 (1) mX1000 式中： X一一试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）： 由标准曲线得出的样液中被测组分的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； 样液最终定容体积，单位为毫升（mL） 最终样液所代表的试样质量，单位为克（g）； m 稀释倍数。 X 8测定低限、回收率 8.1测定低限 本方法的测定低限为： 苯甲酸：2.5mg/kg；山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯 甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯：1.0mg/kg。 8.2添加回收率 添加浓度和回收率数据见表1。 表1不同基质中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯添加浓度及回收率范围 添加浓度 回收率范围 样品名称 化合物 mg/kg % 2.5 90.3~96.6 苯甲酸 5.0 91.7~98.9 10.0 94.4~101.3 鲜牛乳 1.0 93.9~100.3 山梨酸 2.0 93.5~102.5 5.0 96.1~101.2 3