SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4253—2015 出口动物组织中抗病毒类药物残留量的 测定氵 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of anti-viral drugs residues in animal tissues for export- LC-MS/MSmethod 2016-01-01实施 2015-05-26发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4253-2015 言 前 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：刘正才、林永辉、钱疆、杨方、余孔捷、潘迎芬、陈建、陈旭东。 I SN/T4253—2015 出口动物组织中抗病毒类药物残留量的 测定液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了出口动物组织中金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、阿昔洛韦、咪喹莫特、吗啉胍、奥司他韦 7种抗病毒类药物残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法 本标准适用于鸡肉、鸡肉制品、猪肉、肝脏、鱼、虾、蛋、皮蛋等动物组织中金刚烷胺、金刚乙胺、美金 刚、阿昔洛韦、咪喹莫特、吗啉胍、奥司他韦7种抗病毒类药物残留量的定量测定和确证。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样中7种抗病毒类药物用三氯乙酸-乙腈混合溶液提取并沉淀蛋白，经混合型阳离子交换固相萃 取柱净化后，液相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1E 甲醇：色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 甲酸：色谱纯。 4.4 三氯乙酸。 4.5 二甲基亚砜。 4.6 氨水：含量为25%~28%。 4.7 乙酸铵：色谱级纯。 4.8 2%甲酸溶液：移取2.0mL甲酸，用水稀释并定容至100mL。 4.9 三氯乙酸溶液（20g/L）：称取20g三氯乙酸，溶于1L水中，混匀后备用。 4.10三氯乙酸溶液-乙腈（90+10体积比）：量取900mL三氯乙酸溶液（4.9），加人100mL乙腈， 混匀。 4.115mol/L乙酸铵溶液：称取38.5g乙酸铵至约80mL水中，用氨水调节pH至7.0（士0.2)后定容 至100mL。 4.121%甲酸乙腈溶液：移取1.0mL甲酸，用乙稀释并定容至100mL。 4.13混合型阳离子交换固相萃取柱洗脱液：准确移取2.5mL氨水和2.5mL乙酸铵溶液（4.11）加人 95mL的甲醇中，混匀后备用。 SN/T4253—2015 4.14定容液：70mL乙腈、10mL甲醇与20mL水混匀。 4.155mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵至约800ml水中，加人2mL甲酸后定容至 1000mL，混匀。 4.16标准品：金刚烷胺（amantadine，CAS号768-94-5）、金刚乙胺（rimantadine，CAS号1501-84-4）、美 金刚（memantine，CAS号41100-52-1）、阿昔洛韦（acyclovir，CAS号59277-89-3）、咪喹莫特 （imiquimod，CAS号99011-02-6）、吗啉胍（moroxydine，CAS号3731-59-7）、奥司他韦（oseltamivir，CAS 号196618-13-0)纯度均大于98.0%；同位素内标标准品：金刚烷胺_D6，美金刚_Ds，阿昔洛韦_D，纯度均 大于99.0%。 4.17标准储备液（100μg/mI）：准确称取适量的金刚烷胺、金刚乙胺、美金刚、阿普落韦、咪喹莫特、吗 啉胍、奥司他韦以及同位素内标标准品，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备液，阿昔洛韦先用少 量二甲基亚砜溶解，然后用50%甲醇/水分别配制成100=g/mL的标准储备液，一18℃冰箱中避光保 存，有效期为6个月。 4.18混合标准中间液（1μg/mL）分别准确量取1.00mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇 稀释至刻度，一18℃冰箱中避光保存，有效期为3个月。 4.19混合内标中间溶液（1μg/mL）：移取1.00mL的内标标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀 释至刻度，一18℃冰箱中避光保存，有效期为3个月。 4.20同位素内标工作溶液（0.1μg/mL）：移取1.00mL的内标标准中间液至10mL容量瓶中，用乙睛 稀释至刻度，一18℃冰箱中避光保存，有效期为3个月。 4.21标准工作液：临用时根据需要，移取适量的中间标准溶液（4.18）和中间内标溶液（4.19），用空白定 容液（4.14）稀释至合适浓度，作为混合标准工作液，1℃~4℃冰箱避光保存，可使用1周。 4.22混合阳离子交换固相萃取小柱：60mg/3mL，或相当者。使用前依次用3mL甲醇，3mL水和 3mL2%甲酸活化，保持柱体湿润。 4.23滤膜：0.22μm，有机系。 5仪器和设备 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离（ESI源 5.2 天平：感量0.1mg和0.01g 5.3 组织捣碎机。 5.4 高速冷冻离心机：4℃冷冻，最高转速可达18000r/min 5.5 离心机：最高转速可达5000r/min 5.6 漩涡振荡器。 5.7 pH计。 5.8 氮吹仪。 5.9 固相萃取装置。 6试样制备 6.1 试样制备 鸡肉、肝脏、鱼肉放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成2份，分别装入清洁容器内，并标明标记； 鸡肉制品取鸡肉部分；蛋、虾去壳后取可食部分后放人组织捣碎机均质，充分混匀，均分成2份，分别装 入清洁容器内，并标明标记。 制样操作过程中，应尽可能防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 2 SN/T4253—2015 6.2试样保存 试样于一18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72h。 分析步骤 7.1 提取 称取约5g试样（精确至0.01g）于50mL的离心管中，加入0.1mL内标标准工作溶液（4.20），加 人15mL三氯乙酸溶液（4.10），加盖后在超声波发生器中超声10min，再漩涡混匀3min，4℃条件下 15000r/min离心5min，取出上清液，再加人10mL三氯乙酸溶液（4.10)重复提取一次，离心后合并上 清液至25mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度。 7.2净化 准确移取5mL上清液，加人到活化过的混合阳离子交换固相萃取小柱，依次用5mL甲酸溶液 （4.8）、3mL1%甲酸乙腈（4.12）淋洗，弃去全部流出液；然后真空抽干固相萃取小柱5min，用4.0mL 洗脱溶液（4.13)洗脱至10mL玻璃管中，在50℃用氮气浓缩仪吹至近干。准确加入1.0mL乙睛-甲 醇-水溶液（4.14)溶解残渣，涡旋30s后过0.22μm滤膜，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。此样液应在 48h内测定完毕。 7.3 液相色谱-质谱/质谱仪测定 7.3.1 液相色谱条件 液相色谱参考条件： 色谱柱：BHEAmide(2.1mm×100mm，5μm），或相当者； a) 流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸），B为乙腈，洗脱程序见表1。 表1# 梯度洗脱程序 时间/min A/ % B/% 0 5 S6 2 5 95 4 30 70 5 60 40 6 95 10 5 95 c) 流速：0.4mL/min; d) 柱温：30℃； e) 进样量：2μL。 7.3.2 质谱条件 质谱参考条件如下： 离子源：电喷雾源（ESI)，正离子模式； 3