SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4251—2015 出口贝类中原多甲藻酸类贝类毒素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of azaspiracid shellfish poison residues in shellfish for export- LC-MS/MS method 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共，和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 42512015 前言 准体系》。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑秋月、孙兴权、曹际娟、那晗、肖珊珊、李一尘、张丕桥、王刚。 1 SN/T4251-—2015 出口贝类中原多甲藻酸类贝类毒素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了出口贝类中原多甲藻酸类贝类毒素（AZA1，AZA2，AZA3）残留量测定的液相色谱 质谱/质谱测定方法。 本标准适用于扇贝、牡蛎和杂色蛤等贝类中原多甲藻酸类贝类毒素（AZA1，AZA2，AZA3）残留量 的定量测定和确证。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 试样用80%甲醇溶液提取，提取液经正已烷脱脂、三氯甲烷再萃取并旋转蒸发浓缩后，固相萃取柱 净化，液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1E 甲醇：色谱纯。 4.2 乙：色谱纯。 甲酸：色谱纯。 4.4 正已烷。 4.5 三氯甲烷。 4.6 乙酸钠(CHCOONa·3HzO)。 80%甲醇溶液：量取800mL甲醇，加水至1000mL，混合均匀。 4.8 50mmol/L乙酸钠溶液；称取6.80g乙酸钠（4.6），加水溶解并定容至1000mL，混合均匀。 4.9 淋洗液：量取950mL50mmol/L乙酸钠溶液（4.8），加甲醇定容至1000mL，混合均匀。 4.10洗脱液：量取98mL甲醇，加2mL甲酸（4.3），混合均匀。 4.11（ 0.1%甲酸溶液：取1mL甲酸（4.3），用水稀释至1000mL。 4.12原多甲藻酸标准品：AZA1、AZA2和AZA3标准品纯度均大于等于95%，标准品信息见附录A 中表A.1。 4.13原多甲藻酸标准储备溶液：取适量标准品（4.12），分别用甲醇溶解稀释，配制成浓度为90ng/mL 的标准储备溶液，于一1.8℃避光保存。 1 SN/T4251—2015 4.14混合标准储备液：分别吸取适量的AZA1、AZA2和AZA3标准储备液（4.13），用甲醇配制成混合 标准储备液，使得混合标准储备液中AZA1、AZA2和AZA3的浓度均为30ng/mL。于一18℃避光 保存。 4.15混合标准工作液：根据需要用甲醇将混合标准储备液（4.14）逐级稀释，配成浓度为0.0ng/mL， 0.3ng/mL，1.2ng/mL，2.4ng/mL，30ng/mL的一系列混合标准工作液，于4℃避光保存。 4.16固相萃取柱：混合型阴离子交换固相萃取柱，150mg，6mL，或相当者。 4.17微孔滤膜：0.22μm，有机相。 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2 分析天平：感量为0.01g。 5.3 组织捣碎机。 5.4 均质器：最高转速10000r/min。 5.57 高速冷冻离心机：转速可达8000r/min。 5.6 涡旋混合器。 5.7[ 固相萃取装置。 5.8 鸡心瓶：150mL。 5.9 螺纹帽离心管：聚丙烯，50mL。 5.10 容量瓶：10mL。 6试样制备与保存 6.1试样的制备 将贝类试样外壳用净水清洗后，去壳，再清洗壳内组织，去除海水和泥沙等杂质。取代表性试样的 可食部分约500g作为试样，用组织捣碎机充分捣碎或均质处理，均分成2份，分别装入洁净容器中，密 封，并标明标记。提取分析前取100g试样均质1min，备用待测。 6.2试样的保存 试样于一18℃下冷冻避光存放。 试样制备与保存过程中应防止试样受到污染或发生残留物含量的变化， 7测定步骤 7.1提取 称取2g试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加入80%甲醇溶液（4.7)8mL，涡旋提取 2min，4℃下以8000r/min离心5min，转移上清液于另一离心管中，残渣中加入80%甲醇溶液8mL 重提一次，合并上清液。提取液中加人正已烷5mL，1500r/min涡旋提取1min，静置分层后去正已烷 层。提取液中再加人三氯甲烷15mL，1500r/min涡旋提取2min，4℃下以8000r/min离心2min， 转移下层液至鸡心瓶中，在50℃水浴上旋转蒸发至近干。加人甲醇1mL溶解残渣后，再加人4mL 水，混合均匀，待净化。 2 SN/T 42512015 7.2净化 混合型阴离子交换固相萃取柱（4.16)使用前依次用5mL甲醇和5mL水活化。将上述所得试样 提取液过该固相萃取柱，弃去流出液，用5mL淋洗液（4.9）洗涤，弃去流出液，用5mL洗脱液（4.10）洗 脱，收集全部洗脱液，加甲醇定容至10mL，混合均匀，过0.22um滤膜，供高效液相色谱串联质谱仪 测定。 7.3测定 7.3.1高效液相色谱参考条件 7.3.1.1 色谱柱：C18柱，150mm×4.6mm（内径），5μm，或相当者。 7.3.1.2 流动相：0.1%甲酸水溶液-乙睛，梯度洗脱程序见表1。 7.3.1.3 进样量：5μL。 7.3.1.4 柱温：35℃。 7.3.1.5 流速：1.0mL/min。 表1梯度洗脱程序 时间/min 0.1%甲酸水溶液/% 乙腈/% 0. 00 60 40 2. 50 10 06 4. 50 10 06 4. 51 60 40 6. 00 60 40 7.3.2 质谱/质谱参考条件 7.3.2.1 电离模式：电喷雾电离，正模式。 7.3.2.2扫描模式：多反应监测(MRM)模式。监测离子对（m/z）参见附录B表B.1。 7.3.2.3 其他仪器条件参见附录B。 7.3.3 标准曲线的绘制 （4.15），按浓度由低到高的顺序进样检测，以定量离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线。 7.3.4定性 按照上述条件测定试样和标准工作溶液，AZA1、AZA2和AZA3的参考保留时间分别约为 3.0min、3.1min和2.8min，相关多反应监测（MRM)离子色谱图参见附录C中图C.1。如果试样中目 标化合物的保留时间与标准工作溶液中的一致（变化范围在士2.5%之内），且其中目标化合物各离子对 的相对丰度与浓度相当的标准溶液一致（相对丰度偏差在表2规定的范围内），则可判定试样中含有原 多甲藻酸类贝类毒素。 3 SN/T 4251—2015 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差/% ± 20 ± 25 ±30 0S干 7.3.5 5定量 待测样液中原多甲藻酸类贝类毒素的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后 再进样分析。 7.3.6 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 8结果计算和表述 试样中原多甲藻酸类贝类毒素的含量由色谱数据处理软件或按式（1)计算获得，计算结果需扣除空 白值： ...(1 ) m×1000 式中： 试样中原多甲藻酸类贝类毒素残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； 从标准曲线上得到的试样中原多甲藻酸类贝类毒素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； C; V 样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； 最终样液代表的试样质量，单位为克（g）。 m 9测定低限（LOQ)和回收率 9.1 测定低限（LOQ) 原多甲藻酸类贝类毒素AZA1、AZA2和AZA3的测定低限均为1.5μg/kg。 9.2 2添加浓度和回收率 原多甲藻酸类贝类毒素在不同基质中的添加浓度和回收率情况参见附录D。 SN/T 4251—2015 附 录 A （规范性附录） 原多甲藻酸类贝类毒素标准品信息 原多甲藻酸类贝类毒素标准品信息见表A.1。 表A.1 原多甲藻酸类贝类毒素标准品信息 化合物 英文名称 CAS号 分子式 相对分子质量 AZA1 Azaspiracid-1 214899-21-5 C, Han NO2 842.1 AZA2 Azaspiracid-2 265996-92-7 Ca Hrs NO12 856.1 AZA3 Azaspiracid-3 265996-93-8 Chs Hsg NOt2 828. 04