SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4161--2015 国境口岸副溶血性弧菌实时荧光 PCR 方法 Detection method for vibrio parahaemolyticus by real-time fluorescence PCR at frontier ports 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4161-2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江西出人境检验检疫局 本标准主要起草人：胡婷、杨春华、刘岚、孙思扬、谢玉萍、徐菱菱、周延。 SN/T4161—2015 国境口岸副溶血性弧菌实时荧光 PCR方法 1范围 本标准规定了国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR检验的对象、标本的采集、运输和保存，操作方 法及结果报告。 本标准适用于国境口岸副溶血性弧菌感染的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.17一2003食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验 GB/T4789.20-2003食品卫生微生物学检验 水产食品检验 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因检验实验室技术要求 WS/T230 ）临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 副溶血性弧菌 vibrioparahaemolyticus 副溶血性弧菌，属弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。临床上 以急性起病、腹痛、呕吐、发烧、腹泻及水样便（重症者为黏液便或黏血便)为主要症状。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) PCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction） TaqDNApolymerase:TaqDNA聚合酶 5 检测对象 5.1 疑似副溶血弧菌感染者的临床标本，如粪便。 5.2 疑似副溶血弧菌污染环境标本，如水样，以及食品。 1 SN/T4161--2015 6实验室生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193的规定 执行。 7仪器与器材 7.1 实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。 7.2 生物安全柜。 7.3 高速冷冻离心机：最大转速13000/min以上。 7.4 台式离心机（离心速度900g） 7.5 涡旋振荡器。 7.6 恒温水浴锅。 7.7 高压灭菌锅。 7.8 低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱。 7.9 可调式微量加样器。 8试剂 8.1 生理盐水：蒸馏水和NaCI配制浓度为-0.9%的生理盐水。 8.2 阳性对照品：人工制备含副溶血弧菌检测序列的质粒。 阴性对照品：灭菌双蒸水ddH20。 8.4 DNA提取液：含0.9%NaCI和0.1%EDTA-Na的混合液 9 检测程序 9.1 样品的采集 9.1.1粪便样本 采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集5g~8g，水样便采集1ml～3ml。 亦可用湿润的直肠棉拭插入直肠内3cm~5cm处并轻轻旋转，有可见粪便的棉拭放人采便管内。采 便管外表贴上带有唯一标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。 9.1.2水样标本 水样用无菌容器采集3mL～5mL，密闭后外表贴上带有唯-识别标识号码的标签，直接用于检 测，或保存，或送检。 9.1.3食品标本 9.1.3.1肉与肉制品的取样方法按GB/T4789.17—2003中的规定。 9.2样本的运转与保存 样本运输采用冰壶加冰密封运输。对于不立即检测的样本，应保存于一20℃待检。 2 SN/T4161—2015 9.3样本的前处理 9.3.1 粪便样本 挑取米粒大小粪便，放置于有0.5ml生理盐水的离心管中，振荡混匀，16200g离心2min。去尽 上清，沉淀用于核酸提取。 9.3.2水样样本 取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。 9.3.3食品样本 以无菌方法取肉类或水产品组织样品0.1g，用0.2mL无菌生理盐水离心管中研磨，然后100℃沸 水中加热5min；8000g离心3min，上清用于以后的荧光PCR反应。 9.4样本的DNA提取 在标本的前处理沉淀中，加人100LDNA提取液充分混匀，沸水浴10min。16200g离心 5min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按照说明书操作。 9.5实时荧光PCR检测 9.5.1待检测所需各种试剂充分融化后，请先将各试剂进行离心-30s然后开始实验。应用其他等效试 剂盒进行实时荧光PCR检测时，应根据实际情况进行适当的体系优化后再进行检测。 9.5.2 实时荧光PCR引物、探针序列，见表1 表1 副溶血性弧菌核酸实时荧光PCR引物探针序列 基因 引物名称 核酸序列（5-3） 长度（bp） 类别 上游引物 CAAGGTTTTGAGGTGGAT 18 toxR 下游引物 AATCCTTCAACATCTTACG 19 探针 FAM-CAAGCCTGACTCAAGCGATT-BHQL 20 种特异性基因 上游引物 TGAAGGTTTGACTGCCGTTGT 21 gyrB 下游引物 TGGGTTTTCGACCAAGAACTCA 22 探针 FAM-TTCTCACCCATCGCCGATTCAACCGC-BHQ1 26 上游引物 TACAACAATCAAAACTGAATC 21 trh 下游引物 CATCTTTGTWAGGTTTTCTTTT 22 探针 FAM-CGGTTTGTCCAATAGTCCTCCAC-BHQ1 23 毒力基因 上游引物 GCTGAGAAGTTTGTGTTC 18 tdh 下游引物 CGAAGATAAGGTTTCAACTC 20 探针 FAM-CAACAACAGCAACTCACCGC-BHQ1 20 3 SN/T4161—2015 9.5.3 荧光PCR反应体系配置按表2中的顺序，依次加入。 表2副溶血性弧菌核酸实时荧光PCR检测反应体系 名称 体积 2× PCR Buffer* 12.5 μL 上游引物（12.5μmol/L） 1.0 μL 下游引物(12.5μmol/L) 1.0 μL 0.5 μL 探针（5μmol/L) 模板 3.0 μL Nuclease-Free Water 7.0 μL 25 μL 总体系 TaKaRaPremixExTaqTM试剂盒中组分。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的 唯一认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 9.5.4 设立阴性对照和阳性对照。 9.5.5荧光PCR反应：将加好样的PCR反应管分别转移到荧光定量PCR检测仪上进行扩增反应。荧 光通道检测选择：FAM通道。荧光PCR扩增程序按照表3中的程序进行设置，反应总体积为25μL。 9.5.6首先进行种特异性基因检测，若检测为阳性，则继续进行毒力基因检测；若种特异性基因检测为 阴性，则无需进行毒力基因检测。 表3副溶血性弧菌核酸实时荧光PCR的反应程序 步骤 反应温度 时间 是否采集荧光信号 循环数 变性 95℃ 5 min 否 1 95 ℃ 5 s 否 扩增及荧光收集 40 60℃ 30 s 是 9.6 结果判定及报告 9.6.1 阴性对照Ct值应显示O，阳性对照Ct值≤36并有典型的扩增曲线，否则此次检测结果无效，需 重做。 9.6.2 当同时进行的阳性对照以及阴性实验结果正常，本方法检验结果判定如下： 检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤36时，判为阳性； 检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于36和40之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重 新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数 增长期，判为阳性。此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性； 检测样品无荧光增幅现象，判为阴性。 本方法报告模式如下： SN/T 4161—2015 一若种特异性基因toxR/gyrB两者之一结果为阳性，且毒力基因trh/tdh两者之结果为阳性 即报告副溶血性弧菌核酸阳性且含毒力基因； 若种特异性基因toxR/gyrB两者之一结果为阳性，且毒力基因检测为阴性则报告为副溶血性 弧菌核酸阳性，但不含毒力基因； 一若种特异性基因toxR/gyrB检测均为阴性，则报告为副溶血性弧菌阴性 5