ICS 71.040.40 SN G 09 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4154—2015 化学品 皮肤变态反应局部 淋巴结试验：DA Chemicals-Skin sensitization local lymph node assay : DA 2015-02-09发布 2015-09-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 化学品皮肤变态反应局部 淋巴结试验：DA SN/T4154—2015 * 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网址www.spc.net.cn 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×1230 1/16 印张0.75 字数18千字 2017年6月第一版 2017年6月第一次印刷 印数11100 * 书号：155066·2-31750 定价16.00 元 SN/T4154—2015 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草， 本标准与联合国经济合作与发展组织（OECD)化学品测试方法No.442A（2010)《皮肤变态反应局 部淋巴结试验：DA》（英文版）有关技术内容一致。 本标准做了下列结构和编辑性修改： 一将简介改为引言； 一增加了“范围”一章； 一增加了“规范性引用文件”一章； 将附录1改为术语、定义和缩略语一章； 一删除OECD的参考文献部分。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、浙江出入境检验检疫局、宁波出人境检 验检疫局。 本标准主要起草人：王华、李宁涛、何沁、孙运、张园、徐斌、刘凤娟、赵琢、刘伟、柳明、张媛媛。 I SN/T 4154—2015 引言 OECD化学品测试导则鉴于科学进步、不断改变和调整的需要以及动物福利，会定期进行评审。 第一版用于检测小鼠皮肤致敏的优先测试导则-局部淋巴结试验（缩写为LLNA，导则429），已于2002年 修订。LLNA的验证细节和相关工作的总结已公布。在LLNA中，采用放射性同位素标记的胸苷或 碘来检测淋巴细胞增殖，所以该方法在放射性示踪物的获取、使用和处置方面有局限性。LLNA：DA （由Daicel化学工业公司研发）是一种无放射性的改进的LLNA测试方法，该方法通过生物发光法检测 三磷酸腺苷（ATP)的含量，作为淋巴细胞增殖的指示剂。LLNA：DA试验方法已通过国际同行的验 证、评审和推荐，认为可以用于鉴别某些特定的皮肤致敏物。本标准用于评估化学品对动物的皮肤致敏 性。GB/T21608一2008采用豚鼠作为实验动物，分为豚鼠最大值试验和Buehler试验。LLNA（导则 优化动物使用方面都要优于GB/T21608一2008。 据。此外，本标准不需要使用放射性标记的DNA来检测皮肤致敏物，避免了放射性职业暴露的可能性 和废弃物处置问题。本方法可能增多小鼠的使用量，从而减少豚鼠作为皮肤致敏检测的数量。 SN/T 4154-2015 化学品皮肤变态反应局部 淋巴结试验：DA 1范围 本标准规定了局部淋巴结试验在检测和评价化学品接触致敏性试验的术语、定义和缩略语、注意事 项与限制、试验原则、试验准备、试验程序、试验步骤、观察、结果计算、数据和报告。 本标准适用于检测化学品的皮肤致敏性。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T21608一2008化学品皮肤致敏试验方法 3 3术语、定义和缩略语 界定下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 3.1 精度accuracy 按照制定测试方法得到的结果与公认的参考值之间的接近程度。它是衡量测试方法的操作和是否 适宜的一个方面。术语“一致性”经常互换用于定义试验方法正确结果的比例。 3.2 标准物质benchmarksubstance 与受试物相比具有致敏或非致敏作用的标准物质。标准物质应具备以下属性：（1)一致的和可靠的 来源：（2)与受试物的结构和功能相似：（3)已知的物理/化学特性；（4)已知影响的数据；（5)在所期望的 反应范围内具有已知的效应。 3.3 假阴性falsenegative 受试物的测试结果错误地认定为阴性或无活性，而事实上，它是阳性或具有活性的。 3.4 假阳性falsepositive 受试物的测试结果错误地认定为阳性或有活性，而事实上，它是阴性或无活性。 3.5 风险hazard 不利健康或生态环境的潜在可能性。不利影响仅在足够浓度暴露情况下出现。 3.6 实验室间的重现性inter-Iaboratoryreproducibility 衡量不同资质实验室使用相同试验规程和受试物，产生的质量和数量上相似的结果的可能性。实 验室间重现性在初步确认和确认过程中确定，指示试验方法在不同实验室间成功实施的程度。 1 SN/T4154—2015 3.7 实验室内重现性intra-laboratoryreproducibility 衡量在同一实验室的具有资质人员在不同时间使用某一试验规程能够成功复制结果的可能性。 3.8 离群值outlier 在同一个总体中一个随机样本的数值与其他数值显著不同。 3.9 质量保证qualityassurance 实验室测试标准、需求量、记录保管规程和数据传送准确度的管理程序，需要非执行测试的独立人 员进行评估。 3.10 可靠性reliability 衡量实验室内和实验室间采用相同的规程，长时间执行试验方法的重现性。通过计算实验室内和 实验室间的重现性进行评估。 3.11 皮肤致敏性 Eskin sensitization 当易感个体暴露于化学品致敏原导致的免疫过程，可引起皮肤免疫反应，从而导致发展为接触 致敏。 3.12 刺激指数stimulationindex（SI) 用于评估受试物的皮肤致敏性的计算值，是受试组和溶剂对照组的增殖比。 3.13 受试物tested substance 采用本标准的任何物质，无论是单一成分还是混合物（例如，最终产物、组成成分）。当检测组成成 分时，应考虑某些主管部门仅需要最终产物的试验结果。然而，也可能是要求对产品组分的活性成分进 行测试。 4注意事项与限制 4.1ILLNA：DA是作为鉴别皮肤致敏物的改进LLNA方法，具有某些局限性。虽然并不是所有的情 况都能用LLNA：DA代替LLNA或者豚鼠试验（例如GB/T21608一2008），但是本标准在作为鉴别阳 性或阴性结果时，不需要进一步确认。在试验开始前，需考虑受试物所有的相关信息。这些信息包括鉴 别受试物的化学结构、理化性质、任何体外或体内的毒性试验结果以及与受试物结构相似物质的毒理学 数据。考虑这些信息是为了确定LLNA：DA方法是否适用于受试物（LLNA：DA方法受限的不相容受 试物类型见下）和剂量选择。 4.2LLNA：DA是体内试验，所以不可避免的使用动物作为评价受试物的致敏性。但是与豚鼠试验 致敏试验中动物的使用方式不同，提供了实质性的优化（减少痛苦和刺激），LLNA：DA不需要激发-诱 导皮肤超敏反应。尽管LLNA：DA要优于GB/T21608一2008，但是在特定条件下仍然需采用 GB/T21608-2008[例如某些金属，皮肤刺激会出现假阳性结果（例如一些表面活性剂），受试物的溶解 度]。另外，受试物含有不确定的功能团时，也许需要豚鼠试验（例如GB/T21608一2008）。LLNA的 限制因素也适用于LLNA：DA的使用。此外，LLNA：DA不适用于能够影响ATP水平的受试物（例如 SN/T4154—2015 结有细胞外ATP)。除了这些限制，LLNA：DA可以适用于检测任何受试物，除非这些受试物可能干扰 LLNA：DA准确度。需要注意的是，当SI为1.8～2.5时出现阳性结果的可能性。这是根据44种SI≥ 1.8的物质的数据，LLNA：DA准确鉴别了32种LLNA刺激物，但未能鉴别出12个LLNA非致敏物 中的3个，这些LLNA非致敏物的SI为1.8～2.5（例如临界阳性）。但是，当同样的数据用来设置SI 值，并通过计算预测致敏性时，这些结果可能过高估计真实的预测结果。 5试验原则 LLNA：DA的基本原理是：致敏物可以诱导处理部位淋巴细胞的增殖。这种增殖与受试物的剂量 及其致敏效力是相关的，从而提供了一种简单的方法定量检测皮肤致敏性。淋巴细胞增殖能力通过比 较每个试验组与溶剂对照组（VC)的增殖平均值来确定。每个试验组与VC组增殖平均值的比，称为 SI，在进一步评估受试物是皮肤致敏物之前应确定SI不小于1.8。本标准的方法基于通过生物发光法 检测ATP含量（与活细胞数量相关）来表示引流耳廓淋巴结的增殖细胞数量。生物发光法利用荧光素 酶通过以下反应催化ATP和荧光素发光： Luciferase ATP+Luciferin+O2 -Oxyluciferin+AMP+PP,+CO2+Light 发光强度与ATP浓度呈线性相关，可通过光度计测量。荧光素-荧光素酶试验对ATP定量是敏感 有效的方法，应用广泛。 6试验方法 6.1动物品种的选择 本试验动物品种为小鼠。首选采用CBA/J品系。可选择未经产和未怀孕的成年雌性小鼠，在试验 开始时，动物应在8～12周龄，应减少体重差异，体重差异不能超过平均体重的20%。另外，当有足够 数据证明品系和性别在本试验中无显著性差异时，可以采用