SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4143—2015 出口动物及其制品中玉米赤霉醇残留量 检测方法 酶联免疫法 Determinationof zeranolresiduesinaminal-derivedproductsforexport- Enzyme-linkedimmunosorbent assay 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4143—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、王赢、朱坚。 1 SN/T4143—2015 出口动物及其制品中玉米赤霉醇残留量 检测方法酶联免疫法 1范围 本标准规定了动物及其制品中玉米赤霉醇残留量的抽样、制样和酶联免疫测定方法。 本标准适用于动物及其制品（牛、猪 免等内脏组织与肌内组织、乳粉和动物尿液中玉米赤霉醇残 留量的筛选检验，阳性结果须用其他方法进行确证。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682、分析实验室用水规格和试验方法 3试样的缩分和保存 试样制备 3.1.1对组织样品：从全部样品中取有代表性样品，去除脂肪、充分绞碎、混匀，用四分法缩分出不小于 1000g试样，密封并加以标识。 3.1.2对动物尿样：从饲养现场收集动物尿液，充分混匀、澄清后，装人清洁密闭容器，试样不小于 50mL，加封后标明标识。 3.2 样品容器 样品应装于合适的清洁干燥容器中，以保持样品的完整性和可追溯性。可采用聚乙烯塑料容器，玻 3.3样品封识 应在每个样品容器的外表贴上标签，标签上注明样品名、样品编号、生产批号、抽样日期、抽样地点、 堆位、抽样人员，并由抽样人员或官方人员加封。 3.4样品保存 3.4.1抽样后样品应立即在-18℃以下冷冻保存，0℃～5℃条件下48h内送达实验室。 3.4.2 在抽样和制样过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 4测定方法 4.1原理 本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应。微孔板上包被有固相化的抗玉米赤霉醇抗体的二抗， 1 SN/T4143—2015 当加入玉米赤霉醇酶标记物、游离玉米赤霉醇（玉米赤霉醇标准或样液）和玉米赤霉醇特异性抗体后，特 异性抗体与二抗相结合，游离玉米赤霉醇与玉米赤霉醇酶标记物竞争数量有限的抗体结合位点，通过洗 涤除去未结合的玉米赤霉醇酶标记物，然后加人底物和发色剂孵育显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸 光度值得出试样中玉米赤莓醇的含量。 4.2 试剂和材料 除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.2.1β-葡萄糖醛酶。 4.2.2 乙醚。 4.2.3 甲醇。 4.2.4 90%乙酸溶液。 4.2.5 0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.8)。 4.2.6 1mol/L氢氧化钠溶液。 4.2.7 玉米赤霉醇酶联免疫定量测定试剂盒：应能满足本方法测定低限要求，参见附录A和附录B。 4.2.8 玉米赤霉醇标准品。 4.3 仪器和设备 4.3.1 酶标仪。 4.3.2 均质器。 4.3.3 离心机。 4.3.4 氮气挥发器。 4.3.5 振荡器。 4.3.6 微量加样器：10μL~100μL，20μL~200μL。 4.3.7 微量多通道加样器：10μL~100μL。 4.3.8 自动洗板机。 4.4 分析步骤 4.4.1 提取 4.4.1.1 组织样品（肌肉，肝脏，肾等） 称取1g去除脂肪的已粉碎样品，加2mL蒸馏水，均质（对肝、肾组织需添加8μLβ-葡萄糖醛酶， 置37℃孵育2h）；加10mL乙醚，用振荡器振荡30s，再上下振荡10min，然后在15℃3000g离心 10min。一25℃放置60min或一60℃放置30min，冻结水相，收集乙醚层。在剩余水相中加5ml乙 醚，重复提取步骤；合并二次乙醚提取物，置60℃氮气流中吹蒸干；加1mL三氯甲烷溶解固体残渣 加3mL1mol/LNaOH，用力振荡30s，在15℃2000g离心10min；吸取上层NaOH溶液相，置于含 有250μL90%乙酸溶液的玻璃瓶中；加5mL乙醚，用振荡器振荡30s，在15℃2000g离心10min； 一25℃放置60min或一60℃放置30min，收集乙醚层。置60℃氮气流中吹蒸干；加0.5mL样品缓 冲液溶解固体残渣供测定用。最后样品稀释倍数为0.5。 4.4.1.2乳粉（奶粉、乳清粉等） 称取1g乳粉样品在2mL0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.8）中混匀；加8μLβ-葡萄糖醛酶，置 37℃孵育10h；加10mL乙醚，用振荡器振荡30s，再上下振荡10min，然后在15℃3000g离心 2 学兔兔bzfxwcon SN/T4143—2015 吹干；加0.5mL样品缓冲液溶解固体残渣供测定用。最后样品稀释倍数为0.5。 4.4.1.3动物尿样 用3mL0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.8）稀释0.5mL尿样；加8μLβ-葡萄糖醛酶，37℃孵育 3h；取C18柱，用2mL甲醇洗柱，2mL0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH4.8）平衡柱；取0.5mL水解产物 过柱；2mL、40%甲醇/水混合液洗柱；1mL80%甲醇解离；氮气吹干，加0.5mL样品缓冲液溶解最后 样品稀释倍数为7.0。 4.4.2测定条件 4.4.2.1操作条件 所有操作应在室温下（20℃～24℃）进行，玉米赤霉醇酶联免疫测定试剂盒中所有试剂的温度均 应回升至室温（20℃～24℃）后方可使用。 4.4.2.2洗板条件 人工洗涤次数4次以上，每次注水量为300μL；自动洗板可以预定4次周期 4.4.2.3酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为450nm。 4.4.3 3测定步骤1》 4.4.3.1测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。 4.4.3.2将一定数量的微孔条插入框架（标准液和样液分别做平行孔），记录标准液和样液的位置 4.4.3.3加50μL玉米赤霉醇酶标记物至每个微孔，加50μL6个玉米赤霉醇标准液（0ng/mL，5ng/mL， 25℃黑暗避光处孵育2h。 4.4.3.5倒掉微孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中的液体，每个 微孔注满重蒸馏水冲洗后倒掉拍干，再重复以上洗板操作5次。 4.4.3.6加50μL底物和50μL发色剂至每个微孔中，轻拍混匀，19℃～25℃黑暗避光处孵育30min。 4.4.3.7迅速加人100μL反应终止液至每个微孔中，轻拍混匀后，在10min内以空气为空白调零，测 量并记录每个微孔溶液450nm波长的吸光度值。 4.4.4平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 4.4.5 5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 4.4.6 6质控点试验 每次测定均应做一个添加玉米赤霉醇标准品的样品，添加浓度为相应产品的最高残留限量。 1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实 验评估后使用这些等效产品。 3 学兔兔bzfxwcon SN/T4143—2015 5结果的计算和表述 5.1计算百分比吸光度值 计算玉米赤霉醇标准液和样液的平均吸光度值，按式（1)分别求得每个玉米赤霉醇标准液和样液的 百分比吸光度值： S A= ×100% ....(1 ) S。 式中： 百分比吸光度值； A S 5ng/mL，1.0ng/mL.0.5ng/mL，0.25ng/mL.0.125ng/mL的玉米赤霉醇标准液或样液 的平均吸光度值； -0ng/mL的玉米赤霉醇标准液的平均吸光度值。 5.2绘制校正曲线 以百分比吸光度值（算术级）为纵坐标，以玉米赤霉醇浓度（ng/g）（对数级）为横坐标，在半对数坐 标纸上，绘制出玉米赤霉醇标准液百分比吸光度值与玉米赤霉醇浓度的校正曲线。每次试验均应重新 绘制校正曲线。 5.3 结果的表述 在5.2绘制的校正曲线上读取样液百分比吸光度值所对应的玉米赤霉醇浓度即为试样中的玉米赤 霉醇残留量（ng/kg）。当测定值<500ng/） /kg时，为玉米赤霉醇未检出；当测定值≥500ng/kg时，为玉 米赤霉醇检测结果阳性，阳性结果 须用其他方法进行确证。 6 确证试验 如被测样品中残留物的残留量大于 限量要求时，应用其他方法进行确证。 7 本方法测定低限 7.1组织中玉米赤霉醇残留物测定低限为0.5g/kg。 7.2乳粉中玉米赤霉醇残留物测定低限为0.5μg/kg。 7.3动物尿样中玉米赤霉醇残留物测定低限为0.25ug/kg。 4 学兔兔bzfxwcon SN/T4143—2015 附录A （资料性附录） 回收率 玉米赤霉醇添加浓度及回收率的试验数据： 肌肉组织： a) 添加量为0.1μg/kg时，平均回收率为58%； 添加量为0.5μg/kg时，平均回收率为75%； 添加量为2.0μg/kg时，平均回收率为107% b) 肝脏组织： 添加量为0.1μg/kg时，平均回收率为62%； 添加量为0.5μg/kg时，平均回收率为81% 添加量为2.0μg/kg时，平均回收率为99 肾脏组织： c) 添加量为0.1μg/kg时，平均回收率为65% 添加量为0.5ug/kg时，平均回收率为76%； 添加量为2.0μg/kg时