SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3567.6-2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第6部分：结核分枝杆菌 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part 6:Mycobacterium tuberculosis 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 甜泽展查真伤 SN/T3567.6-2015 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分： 第1部分：通用技术规程； 一第2部分：霍乱弧菌； 一第3部分：大肠杆菌O157：H7； 一一第4部分：黄热病毒； —第5部分：沙门菌属； 第6部分：结核分枝杆菌； ... 本部分为SN/T3567的第6部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的贵任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、杭州优思达生物技术有限公司。 本部分主要起草人：祁军、左锋、詹曦菁、王馨、牛国宇、尤其敏、胡林。 I SN/T3567.62015 交叉引物恒温扩增检测方法 第6部分：结核分枝杆菌 1范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸采用交叉引物恒温扩增法检测结核分枝杆菌的生物安全 措施、检测对象、试剂和材料、仪器设备及检测程序。 本部分适用于在国境口岸对型结核分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌的筛选检测，以及对国境口岸 出人境人员感染结核分枝杆菌的实验室快速检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T3567.1交叉引物恒温扩增检测方法第1部分：通用技术规程 WS288肺结核诊断标准 人间传染的病原微生物名录（2006) 3术语和定义 SN/T3567.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculpsis TB 俗称结核杆菌，其主要致病种类为人型及牛型结核杆菌，是引起结核病的病原菌。结核病可侵犯全 身各器官，但以肺结核最为常见。结核病仍为国际最常见的传染病之 4生物安全措施 实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006)的规定，由具备相关资格 的工作人员进行。 5检测对象 5.1 疑似人型、牛型结核分枝杆菌的待检菌株。 5.2 结核分枝杆菌感染或疑似结核分枝杆菌感染的痰标本。 6试剂和材料 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括： SN/T3567.6-2015 按照GB/T6682规定的一级水。 -DNA提取液：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。 -10×ThermoPol缓冲液。 -10mmol/LdNTPs溶液：dATP，dTTP,dCTP,dGTP各2.5mmol/L。 BstDNA聚合酶：8U/μL。 甜菜碱溶液：5mo1/L。 硫酸镁溶液：1mol/L。 阳性对照：含有目的片段的质粒DNA。 引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。 7 仪器设备 所用仪器设备如下： 任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。 微量移液器：量程范围为0.5μl~10μL、10μl~100μl、100μ~1000μl。 计时器。 超净工作台。 生物安全柜。 消毒灭菌锅。 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。 台式离心机（最高离心力2000g以上）。 涡旋振荡器。 低温冰箱、冷冻冷藏冰箱 8结核分枝杆菌交叉引物恒温扩增法检测程序 8.1 样本标识 样本应进行唯一性标识。 8.2# 样本采集、细菌增菌及分离鉴定 按照WS288执行。 8.3样本前处理 8.3.1 平板上纯培养物 用无菌接种环从平板上挑取1/4个1个纯菌落，混悬于1mL灭菌或无菌双蒸水或纯水中大于 10000g离心10min，保留沉淀物，备用。 8.3.2 痰液样本 8.3.2.1 痰液液化 取约5mL痰液中加入1倍～2倍体积的4%NaOH溶液，涡旋振荡器振荡混勾，室温下放置 20min～30min，使其充分液化（无明显固状物且吸出时无拖丝现象，若未达到完全液化可适当加人少 量4%的NaOH溶液直至液化完全）。 2 SN/T 3567.6—2015 8.3.2.2洗涤 取1ml液化后痰液至1.5mL离心管，14000g离心10min，尽可能完全倾倒上清，倾倒后剩余的 少量液体需要用移液器吸净（注意不要碰触到沉淀物）；沉淀用1mL生理盐水（质量浓度为0.9%的 NaCI)悬浮，同上离心条件洗涤2次。保留沉淀物，备用。 8.4模板DNA提取 8.4.1 加热煮沸法提取 取上述沉淀物，向其中加人DNA提取液40μL，振荡混匀。混匀后，将其置于95℃～100℃煮沸 8.4.2 2试剂盒提取 按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 8.5 5交叉引物恒温扩增 8.5.1 扩增引物 用于检测结核分枝杆菌的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。 8.5.2阳性对照和空白对照设置 实验过程中需要分别设阳性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作为交叉引 物恒温扩增模板；空白对照则采用无菌水作为交叉引物恒温扩增模板。 8.5.3扩增反应体系 使用封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测CPA扩增产物时，交叉引物恒温扩增参 考反应体系见表1。 表1 结核分枝杆菌交叉引物恒温扩增参考反应体系 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 10×ThermoPol缓冲液 2 μl, 10 mmol/L dNTPs 10 mmol/L 0.8 μl. 剥离引物F和R 20 μmol/L 0.1 μL 交叉扩增引物F和R 20 μmol/1. 0.8 μL, 检测引物F和R 20 μmol/L 0.3 μ MgSO; 100 mmol/l 0.8 μL 甜菜碱 5 mol/L 2 μl, BstDNA聚合酶 8 U/μL 1 μL 模板 50 ng/μL 4 μL O"HPP 补足反应体系至20μL 3 SN/T3567.6——2015 8.5.4扩增反应程序 将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min。 8.5.5扩增产物检测 具体检测步骤见SN/T3567.1。 8.5.6 结果判定 8.5.6.1根据封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）的显色，直接读取检测结果。 8.5.6.2仅在质控区C出现一条红线，判断为检测结果阴性：出现两条红线，一条检测线，一条质控线， 且将检测线强度与色卡进行对照，如强度小于14判断为检测结果阴性，表示样品中无人型及牛型结核 分枝杆菌核酸或核酸拷贝数低于试剂盒最低检测限。 8.5.6.3出现两条红线，一条检测线条质控线，且将检测线强度与色卡进行对照，如强度大于或等于 L4，判断为检测结果阳性，表示样品中含有结核分枝杆菌核酸。 4 SN/T 3567.6-2015 附录A （资料性附录） 结核分枝杆菌CPA检测的引物序列 A.1 剥离引物 TBCF3 5-AGGACCACGATCGCTGATC TBCB3 5-TGGCCATCGTGGAAGCGA A.2 交叉引物 TBCPF 5-TCGGTGACAAAGGCCACGTTACAGCCCGTCCCGCCGAT TBCPR 5-ACAGCCCGTCCCGCCGATTTCGGTGACAAAGGCCACGT A.3 检测引物 TBDR5F 5-FITC-CTGGGCAGGGTTCGCCT TBDR5B 5-BIOTIN-TAGCAGACCTCACCTATGTGTC 5