SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3567.4—2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第4部分：黄热病毒 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part4:Yellowfevervirus 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.4—2015 前 言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：霍乱弧菌； 第3部分：大肠杆菌0157：H7； 第4部分：黄热病毒； 一第5部分：沙门菌属； -第6部分：结核分枝杆菌； 本部分为SN/T3567的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国山东潍坊出人境检验检 疫局、杭州优思达生物技术有限公司。 本部分主要起草人：祁军、王馨、刘恩德、牛国宇、尤其敏、胡林。 I SN/T3567.4—2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第4部分：黄热病毒 1范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测黄热病毒的生物安全措施 检测对象、试剂和材料、仪器设备及检测程序。 本部分适用于在国境口岸对黄热病毒病原体的快速筛选检测， 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T3567.1交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分：通用技术规程 人间传染的病原微生物名录（2006） 3术语和定义 SN/T3567.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 黄热病毒yellowfevervirus；YFV 黄热病毒属于黄病毒科的黄病毒属，是一种虫媒病毒，传播媒介主要为埃及伊蚊。黄热病毒是引起 黄热病的病原体，黄热病属于检疫传染病。 4 生物安全措施 实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资质 的工作人员进行相应操作。 5检测对象 5.1输人性蚊类中伊蚊属，主要是埃及伊蚊。 5.2疑似感染黄热病的出人境人员。 6 试剂和材料 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括： 按照GB/T6682规定的一级水。 1 SN/T3567.4—2015 BA-1稀释液：Hanks液内含50mmol/LTris（pH7.6），BAS，0.35g/I碳酸氢钠，链霉素 100μg/mL，二性霉素1μg/mL。 10×ThermoPol缓冲液。 1ommol/LdNTPs溶液：dATP，dTTP，dCTP,dGTP各2.5mmol/L。 —25XRNASecure。 BstDNA聚合酶：8U/μL。 一AMV逆转录酶：10U/μL。 甜莱碱溶液：5mol/L。 硫酸镁溶液：100mmol/L。 其他：酚-三氯甲烷混合液、异丙醇等。 QIAampViralRNAMinikit(QIAGEN)"。 -引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。 仪器设备 所用仪器设备如下： 任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。 微量移液器：量程范围为0.5μL~10μL；10μL~100μL；100μL~1000μL。 计时器。 超净工作台。 生物安全柜。 消毒灭菌锅。 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。 台式离心机（最高离心力2000g以上）。 涡旋振荡器。 低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。 8 检测程序 8.1 样本标识 样本应进行唯一性标识。 8.2 样品前处理 8.2.1 蚊虫样本 将待检蚊虫放入-20℃冰箱30min以上冻死后取出，按30只～50只一份分组编号，如蚊虫数量 不足30只，将采自同一地点的蚊虫或虫卵做为一组。置于一70℃以下保存。检测时每组样本分别用 含青、链霉素的无菌生理盐水清洗3次，加人2mI.BA-1稀释液后，在组织研磨器中研磨或置于电动匀 浆器中匀浆20s～30s，使样品匀浆成糊状，4℃12000g离心10min，取上清液做为样品。 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果.则可使用这些等效产品。 2 SN/T3567.4—2015 8.2.2 2血清样本 抽取静脉血，室温静止凝固后，分离新鲜血清备用。 8.3模板RNA提取 8.3.1 蚊虫样本模板 在离心管中加人蚊样匀浆100μL及300μL酚-三氯甲烷（25：24）混合液，涡旋混匀30s后；加人 等量异丙醇沉淀RNA，10000g离心3min，吸去上清，将RNA沉淀重悬于100μL不含RNA酶的纯 水中，立即用于交叉引物恒温扩增检测，或利用QIAGEN公司的miRNeasyMinikit试剂盒²"，按照说 明书要求提取RNA。剩余样品置于-80℃低温保存。 8.3.2血清样本模板 应用QIAGEN公司的QIAampViralRNAMinikit试剂盒3，按照说明书要求提取RNA。 8.4交叉引物恒温扩增 8.4.1引物 用于检测黄热病毒的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。 8.4.2阳性对照和空白对照设置 实验过程中需要分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，以黄热病毒疫苗提取获得的RNA作为阳 性对照；空白对照以无RNA酶污染的水作为交叉引物恒温扩增模板。 8.4.3扩增反应体系 使用封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测CPA扩增产物时，交叉引物恒温扩增参 考反应体系见表1。 表1黄热病毒交叉引物恒温扩增反应体系 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 10×ThermoPol缓冲液 2 μL 10 mmol/L dNTPs 10 mmol/L 0.8 μL 剥离引物F和R 20 μmol/L 各0.2μL 交叉扩增引物R 20 μmol/L 0.8 μL 检测引物F和B 20 μmol/L 各 0.4μL MgSO. 100 mmol/L 0.6 μL 甜菜碱 5 mol/ L 1 μL 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 2） 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 3） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 3 SN/T 3567.42015 表1（续） 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 RNA secure 25× 0.8 μL BstDNA聚合酶 8 U/μL 1 μL AMV逆转录酶 10 U/μL 0.2 μL 模板 50 ng/μL 4 μL O"HPP 补足反应体系至20μL 8.4.4 扩增反应程序 将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min。 8.4.5 扩增产物检测 具体检测步骤见SN/T3567.1。 8.4.6 结果判定 8.4.6.1 根据封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）的显色，直接读取检测结果。 8.4.6.2 仅在质控区C出现一条红线，判断为检测结果阴性；出现两条红线，一条检测线，一条质控线， 且将检测线强度与色卡进行对照，如强度小于L4判断为检测结果阴性，则表示样品中无黄热病毒核酸 或核酸拷贝数低于试剂盒最低检测限。 8.4.6.3出现两条红线，一条检测线，一条质控线.且将检测线强度与色卡进行对照：如强度大于或等于 L4，则判断为检测结果阳性，表示样品中含有黄热病毒核酸。 SN/T 3567.42015 附录A （资料性附录） 黄热病毒CPA检测的引物序列 A.1 剥离引物 YFF3 5-GATTTCATTGAGGGGGTG YFB3 5-CTCAGCAGGTCTATCAATGGC A.2 交叉引物 YFCPR 5-TGGAGGAACTTGGGTTTCAG-GATGTCCAATGAAGGCTTGTC A.3 检测引物 YFDF5F5 5-FITC-TGGAGGAACTTGGGTTTCAG YFDF5B 5-BIOTIN-AAGTGTGTCACTGTTATGGC