SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3567.3—2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第3部分：大肠杆菌0157：:H7 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part3:EscherichiacoliO157:H7 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.3—2015 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：霍乱弧菌； 第3部分：大肠杆菌0157：H7； 第4部分：黄热病毒； 一第5部分：沙门菌属； 一第6部分：结核分枝杆菌； 本部分为SN/T3567的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫 局、杭州优思达生物技术有限公司。 本部分主要起草人：祁军、盛鸿颖、周艳容、王馨、尤其敏、胡林。 I SN/T3567.3—2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第3部分：大肠杆菌0157：H7 1范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测大肠杆菌O157：H7的生物 安全措施、检测对象、试剂和材料、仪器设备及检测程序。 本部分适用于在国境口岸对大肠杆菌O157：H7菌株的快速筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB17012 感染性腹泻的诊断标准及处理原则 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SNT 2754.2 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第2部分：大肠杆菌 O157:H7 SN/T3567.1 交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分：通用技术规程 人间传染的病原微生物名录（2006） 3术语和定义 SN/T3567.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大肠杆菌0157:H7 EscherichiacoliO157:H7 大肠埃希菌的一种特殊血清型，能引起人类的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒症、血小板减 少性紫癜等。严重时可致人死亡。 4生物安全措施 实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资质 的工作人员进行。 5检测对象 5.1臭 疑似大肠杆菌O157：H7的待检菌株， 5.2 2肠道出血性大肠杆菌感染病例或疑似肠道出血性大肠杆菌感染者的粪便、血液及其增菌液。 SN/T3567.3—2015 5试剂和材料 6 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括： 按照GB/T6682规定的一级水。 DNA提取液：5%Chelex水溶液。 -10×ThermoPol缓冲液。 10mmol/LdNTPs溶液：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L。 BstDNA聚合酶：8U/μL。 甜菜碱溶液：5mol/L。 硫酸镁溶液：1mol/L。 引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。 7 仪器设备 所用仪器设备如下： 任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。 微量移液器：量程范围为0.5μ~10μ、10μ~100μ、100μ1000μ。 计时器。 超净工作台。 生物安全柜。 消毒灭菌锅。 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。 台式离心机（最高离心力2000g以上）。 涡旋振荡器。 低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。 8检测程序 8.1 样本标识 样本应进行唯一性标识。 8.2样本采集、细菌增菌及分离鉴定 按照GB17012、GB/T4789.6和SN/T2754.2执行。 8.3样本前处理 8.3.1大肠杆菌0157：H7疑似菌株 8.3.1.1 科玛嘉平板上纯培养物 用无菌接种环挑取1/4～1个菌落，混悬于100μL灭菌或无菌双蒸水或纯水中。 8.3.1.2LST肉汤或EC肉汤中的纯培养物 取增菌液1mL加到1.5mL离心管中，以7000g离心2min集菌，弃去上清液取沉淀物。 2 SN/T3567.3—2015 8.3.2粪便样本 直接从粪便样本中提取模板时，选取有脓血、黏液部分的成形便3g～5g，水样便取含絮状物的 1mL~3mL，加人6mLpH7.4PBS混匀，500g离心5min~10min，收集上清液于1.5mL离心管 中，此步骤重复3次，上清液5000g离心10min，弃去上清液，沉淀物在1mL双蒸水（ddHz0)中悬 置，混和后，20000g离心5min，收集沉淀。将沉淀溶于200μL无水乙醇（一20℃预冷），振荡混匀后， 20000g离心2min，弃上清，此步骤重复3次。 8.3.3 血液样本 无需前处理。 8.4 模板DNA提取 8.4.1加热煮沸法提取 取40μL经前处理的样本，向其中加人DNA提取液40μL，振荡混匀。混匀后，将其置于95℃~ 100℃煮沸10min，室温冷却，20000g离心5min，上清液即可作为扩增模板。上清液转移至一20℃ 冰箱备用。 8.4.2 试剂盒提取 按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 8.5交叉引物恒温扩增 8.5.1扩增引物 用于检测大肠杆菌O157：H7的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。 8.5.2 阳性对照和空白对照设置 实验过程中需要分别设阳性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作为交叉引 物恒温扩增模板，空白对照则采用无菌水作为交叉引物恒温扩增模板。 8.5.3扩增反应体系 使用封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测CPA扩增产物时，分别建立了检测 strA1基因和strA2基因的两个交叉引物恒温扩增反应体系，见表1和表2。 表1stxA1基因恒温扩增参考反应体系 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 10×ThermoPol缓冲液 2 μL 10 mmol/L dNTPs 10 mmol/L 0.8 μL 剥离引物F和R 20 μmol/L 各0.1μL 交叉扩增引物F 20 μmol/L 0.3 μL 检测引物F和R 20 μmol/L 各0.2μL MgsO. 100 mmol/L 0.6 μL 3 SN/T 3567.3—2015 表1（续） 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 甜菜碱 5 mol/ L 2 μL BstDNA聚合酶 8 U/μL 1 μL 模板 50 ng/μL 1 μL~4 μL ddH,0 补足反应体系至20μL 表2 stxA2基因恒温扩增参考反应体系 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 10×ThermoPol缓冲液 2 μL 10 mmol/L, dNTPs 10 mmol/L 0.8 μL 剥离引物F和R 20 μmol/L 各0.1μL 交叉扩增引物F和R 20 μmol/L 各0.3μL 检测引物F和R 20 μmol/ L 各0.3μL MgSO: 100 mmol/L 0.6 μL 甜菜碱 5 mol/ L 2 μL BstDNA聚合酶 8 U/μL 1 μL 模板 50 ng/μL 1 μL~4 μL ddH,0 补足反应体系至20μL 8.5.4 扩增反应程序 将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min。 8.5.5 扩增产物检测 具体检测步骤见SN/T3567.1。 8.5.6 结果判定 8.5.6.1 根据封闭式-一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）的显色，直接读取检测结果。 8.5.6.2 仅在质控区C出现一条红线，判断为检测结果阴性。出现两条红线，一条检测线，一条质控 线，且将检测线强度与色卡进行对照，如强度小于L4判断为检测结果阴性，表示样品中无大肠杆菌 O157：H7核酸或核酸拷贝数低于试剂盒最低检测限。 8.5.6.3出现两条红线，一条检测线，一条质控线，且将检测线强度与色卡进行对照，如强度大于或等于 L4，判断为检测结果阳性，表示样品中含有大肠杆菌O157：H7核酸。 4 SN/T3567.3-2015 附录A （资料性附录） 大肠杆菌0157:H7CPA检测的引物序列 A.1大肠杆菌O157:H7stxA1基因CPA检测的引物序列 A.1.1 剥离引物 EHECVT1F3 5-CAGTCGTACGGGGATGCAG EHECVT1B3 5-TCAGCAGTCATTACATAAG A.1.2 交叉引物 EHECVTIPF 5-GCTCTTGCCACAGACTGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTTC A.1.3 检测引物 EHECVT1DR5F 5-FITC-AGGTTCCGCTATGCGACAT EHECVT1DR5B 5-BIOTIN-GTTGTACGAAATCCCCTC A.2 2大肠杆菌0157：H7stxA2基因CPA检测的引物序列 A.2.1 剥离引物 EHECVT2F3 5-CAGTTATACCACTCTGCAACGTG EHECVT2B3 5-CTGATTCGCCGCCAGTTC A.2.2 交叉引物 EHECVT2CPF1 5-TGC