SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3567.2—2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第2部分：霍乱弧菌 Detection method of crossing priming isothermal amplification- Part2:Vibriocholerae 2015-12-04发布 2016-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3567.22015 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为以下几个部分 第1部分：通用技术规程； 第2部分：霍乱弧菌； 一一第3部分：大肠杆菌O157：H7； 第4部分：黄热病毒； 一一第5部分：沙门菌属； -第6部分：结核分枝杆菌； 本部分为SN/T3567的第2部分 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检 疫局。 本部分主要起草人：祁军、李燕、王树祥、王馨、胡林。 1 SN/T3567.2—2015 交叉引物恒温扩增检测方法 第2部分：霍乱弧菌 1范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测蜜乱弧菌的生物安全措施、 检测对象、试剂和材料、仪器设备及检测程序。 本部分适用于在国境口岸对O1群霍乱弧菌菌株和O139群霍乱弧菌菌株的筛选检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1022 进出口食品中霍乱弧菌检验方法 SN/T1239 国境口岸霍乱检验规程 SN/T3567.1交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分：通用技术规程 WS289霍乱诊断标准 人间传染的病原微生物名录（2006） 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 SN/T3567.1界定的以及飞列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 霍乱弧菌 首VibriocholeraeVC 引起霍乱的病原体。其主要致病血清群为01群及0139群。霍乱是一种烈性肠道传染病.其发病 急、传染性强、病死率高，属于检疫传染病。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dTTP脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate) dCTP脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate)） dGTP脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） PBS磷酸盐缓冲液（phosphatebulleredsaline） 4 生物安全措施 实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定.由具备相关资格 1 SN/T3567.2-2015 的工作人员进行。 检测对象 5.1 疑似霍乱弧菌的待检菌株。 5.2 霍乱感染病例或疑似霍乱感染者的排泄物、呕吐物及其增菌液。 6 试剂和材料 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，包括： 按照GB/T6682规定的一级水。 -DNA提取液：5%Chelex水溶液。 -10×ThermoPol缓冲液。 10mmol/LdNTPs溶液：dATP，dTTP,dCTP,dGTP各2.5mol/L。 -BstDNA聚合酶：8U/μL。 一甜菜碱溶液：5mol/L。 硫酸镁溶液：1mol/L。 引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。 仪器设备 所用仪器设备如下： 任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。 微量移液器：量程范围为0.5μL～10μL、10μL~100μ、100μ~1000μL。 一计时器。 超净工作台。 一生物安全柜。 消毒灭菌锅。 高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。 台式离心机（最高离心力2000g以上）。 一涡旋振荡器。 一低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。 8 检测程序 8.1 样本标识 样本应进行唯一性标识。 8.2 样本采集、细菌增菌及分离鉴定 按照WS289、SN/T1239和SN/T1022执行。 2 SN/T3567.2—2015 8.3样本前处理 8.3.1 疑似霍乱弧菌的待检菌株 8.3.1.1培养基上纯培养物 用无菌接种环挑取1/4～1个菌落，混悬于100μL灭菌或无菌双蒸水或纯水中。 8.3.1.2 LB或碱性蛋白陈水的处理纯培养物 取纯培养的1mL加到1.5mL离心管中，以14000g离心2min集菌，弃去上清液，用1mL生理 盐水或pH7.4PBS洗涤沉淀物，悬浮，4000g离心5min，弃去上清液 8.3.2粪便和呕吐物 直接从粪便和呕吐物样本中提取模板时，可取水样粪便或呕吐物约200μL或200mg·加人1mL pH7.4PBS混匀，300g离心5min，收集上清液于1.5mL离心管中，6000g离心5min，弃去上清液， 保留沉淀。 8.4# 模板DNA提取 8.4.1加热煮沸法提取 取40μL经前处理的样本，向其中加人DNA提取液40μL，振荡混勾。混匀后，将其于95℃～ 100℃煮沸10min，室温冷却，14000g离心5min，上清液即可作为扩增模板。上清液转移至一20℃ 冰箱备用。 8.4.2 试剂盒提取 按适用于细菌基因组提取的试剂盒说明书操作。 8.5交叉引物恒温扩增 8.5.1扩增引物 用于检测霍乱弧菌的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。 8.5.2 2阳性对照和空白对照设置 实验过程中需要分别设阳性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作为交叉引 物恒温扩增模板，空白对照则采用无菌水作为交叉引物恒温扩增模板， 8.5.3扩增反应体系 使用封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测CPA扩增产物时，交叉引物恒温扩增参 考反应体系见表1。 SN/T3567.2—2015 表1 霍乱弧菌交叉引物恒温扩增检测体系 试剂名称 储备液浓度 20μL体系加样量 10×ThermoPol缓冲液 2 μL 10 mmol/L dNTPs 10 mmol/L 0.8 μL 剥离引物F和R 20 μmol/L 各0.1μL 交叉扩增引物F和R 20 μmol/L 各0.2μL 检测引物F和R 20 μmol/L 各 0.2 μL MgsO. 100mmol/L 0.6 μL 甜菜碱 5 mol/L 2 μL BstDNA聚合酶 8 U/μL 1 μL 模板 50 ng/μL 4 μL ddH,0 补足反应体系至20μL 8.5.4 扩增反应程序 将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min。 8.5.5 扩增产物检测 具体检测步骤按照SN/T3567.1执行。 8.5.6 结果判定 根据封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）的显色，直接读取检测结果。 8.5.6.1 8.5.6.2 仅在质控区C出现一条红线，判断为检测结果阴性；出现两条红线，一条检测线，一条质控线， 且将检测线强度与色卡进行对照，如强度小于L4判断为检测结果阴性，表示样品中无霍乱弧菌O1群 及0139群核酸或核酸拷贝数低于试剂盒最低检测限， 8.5.6.3出现两条红线，一条检测线，一条质控线.将检测线强度与色卡进行对照，如强度中大于或等于 L4，判断为检测结果阳性，表示样品中含有霍乱弧菌O1群及0139群核酸。 4 SN/T 3567.2-2015 附录A （资料性附录） 霍乱弧菌交叉引物恒温扩增法检测的引物序列 A.1 剥离引物 VCCF3 5-GCAAATGATGATAAGTTATATCG VCCB3 5-GACCAGACAATATAGTTTGACC A.2 交叉引物 VCCPF 5-TCTGTCCTCTTGGCATAAGACGGCAGATTCTAGACCTCCTG VCCPR 5-GAGTTCCTCTTGCATGATC A.3 检测引物 VCDR5F 5-FITC-TATTCATTTGAGTACCTCGG VCDR5B 5-BIOTIN-CACCTGACTGCTTTATTTCA 5