SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3306.13—2017 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第13部分：疮原虫 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port- Part13:Plasmodium 2017-12-01实施 2017-05-12发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3306.13—2017 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第13部分：疟原虫 1范围 SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似传染病的血样本及蚊虫样本中症原虫的环介导恒 温核酸扩增（LAMP)法。 本部分适用于国境口岸对疟原虫的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 WS259症疾的诊断 SN/T3562国境口岸疟原虫PCR检测方法 人间传染的病原微生物名录卫生部（卫科教发【2006】15号） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) LAMP：环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermal-amplification） TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚 4生物安全措施及防污染措施 实验操作及处理按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定，由具备相关资质的工作 人员进行。 防止污染措施应符合WS/T230的规定。 5技术概要 根据症原虫的特异性毒力基因序列设计特异性内外引物及环状引物各一对，共三对引物，特异性识 别靶序列上的SSUrRNA基因，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应：在特异性基因序列启动互 1 SN/T3306.13-2017 补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，即可通过反 应液中的浑浊程度判定结果。亦可通过加人显色液，通过颜色变化观察判定结果。 6试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6.1引物。 根据疮原虫特有的SSUrRNA靶序列基因（X13926.1)设计一套特异性引物，包括外引物1，外引 物2，内引物1，内引物2和环状引物1,环状引物2。 外引物1(F3,5-3"）):GGAATGATGGGAATTTAAAACCT 外引物2(B3,5"-3"）：ACGAAGTATCAGTTATGTGGAT 内引物1(FIP,5"-3")：CTATTGGAGCTGGAATTACCGCTCCCAAAACTCAATTGGAGG 环状引物1（LF，5"-3"）：GCTGCTGGCACCAGACTT 环状引物2（LB,5，-3'）：AGTTGAATTTCAAAGAATCG 6.2DNA提取液：含20mmol/LTris-HCl(pH8.0)、2mmol/LEDTA和1.2%TritonX-100。 6.3dNTPs：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.4 BstDNA聚合酶：8U/μL。 6.5 10×ThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCI（pH8.8）、100mmol/L（NH,),SO,、 100mmol/L、KCl、20mmol/LMgSO;、1%TritonX-100。 6.61 MgSO，溶液：25mmol/L。 6.7 甜菜碱：5mol/L。 6.8 显色液：浓度为1000×SYBRGreenI。 6.9 阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 6.10 0.2ml.和1.5ml.塑料离心管。 6.11 吸头，配套移液器使用。 仪器和设备 7.1 移液器：量程0.1μ2μ，量程0.5μ～10μ，量程10~100μl，量程100μ~1000μ。 7.2 高速台式离心机：≥7000g。 7.3 水浴锅或加热模块：65℃±1℃和100℃±1℃。 7.4 组织研磨器。 7.5 计时器。 8检测程序 疮原虫检测程序见图1。 2 SN/T3306.13—2017 表1症原虫环介导引物恒温扩增反应体系 体系加样量 试剂名称 储备液浓度 μl. 5.0 10XThermoPol缓冲液 一 F3引物 10 μmol/L 0.5 B3引物 10 μmol/L 0.5 FIP引物 40 μmol/L 0.8 BIP引物 40μmol/L 0.8 L.F引物 100 μmol/L 0.4 LB引物 100μmol/L 0.4 dNTPs 10mmol/L 7.0 甜菜碱 5mol/L 12 硫酸镁溶液 150mmol/L 8.0 BstDNA聚合酶 8 U/μL 1 模板 5 ddH,() 8.6 9.4.2 反应过程 按照表1所述配制反应体系，上述组分加人后，轻柔混匀并短暂离心后加入10μI的凡士林（密封 液），最后将1μL的显色液加人反应管顶端。盖上管盖后，置于65℃恒温扩增60min，观察结果。 9.4.3空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。 空白对照则采用无菌水作为扩增模板。 阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。 阳性对照以含检测序列的质粒DNA作为扩增模板。 9.5结果观察 取出反应管，短暂离心使反应管盖中显色液进人反应体系，3min后根据管内反应液颜色变化，判 断结果。 4 SN/T3306.13—2017 9.6 6结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下： 阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，则报告为LAMP检测阳性。如需通过涂片显微镜检 a) 及抗原检测对上述检测结果进行确认，则按WS259执行。 b) 阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则报告为LAMP检测阴性。 5