ICS 65.020.20 CCS ZBXH B 15 新疆维吾尔自治区植物保护学会 团体标准 T/ZBXH 142—2025 甜菜根腐病镰刀菌分子检测与鉴定技术规 程 Technical code of practice for molecular detection and identification of fusarium spp. of sugar beet root rot 2025 - 9 - 20发布 2025 - 9 - 27实施 新疆维吾尔自治区植物保护学会 发布 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 142 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件中某些内容可能涉及相关知识产权保护内容，本文件的发布机构不承担相关识别等责任。 本文件由新疆维吾尔自治区农业科学院植物保护研究所提出。 本文件由新疆维吾尔自治区植物保护学会归口。 本文件由新疆维吾尔自治区农业科学院植物保护研究所、 中国农业大学起草。 本文件主要起草人：杨安沛，吴学宏，李广阔，张航，韩成贵，白微微，赵灿，曹禹，丁瑞丰，郝 志刚，席欧彦，阿勒合斯•加尔得木拉提。 本文件适用于新疆维吾尔自治区内所有相关单位及组织，自愿采用。 本文件由采用本标准的单位及组织自行承担相关责任。 本文件由新疆维吾尔自治区植物保护学会负责解释。 本文件为首次公布。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 142 —2025 1 甜菜根腐病镰刀菌分子检测与鉴定技术规程 1 范围 本文件本文件规定了甜菜根腐病镰刀菌分子检测与鉴定的程序和方法 。 本文件适用于甜菜根腐病镰刀菌的分子检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 SN/T 2589 植物病原真菌检测规范。 3 术语和定义 甜菜根腐病 Sugarbeet root rot 由真菌或细菌侵染甜菜引起块根腐烂的一类根病的总称。 甜菜根腐病 镰刀菌 Sugarbeet root rot Fusarium 引起甜菜根腐病的镰刀菌属病原菌，其种类有 Fusarium oxysporum 、F. equiseti 、F. solani、F. proliferatum 、F. tricinctum 、F. redolens 、F. brachygibbosum 、F. verticillioides 、F. graminearum 、F. nygamai、F. culmorum 等11种。 分子鉴定 Molecular identification 利用核酸技术对生物中细胞核或非核区特异性的 DNA或RNA进行序列比较，从而区分生物的不同 种属。 4 样品采集、分离、纯化和保存 样品采集 在甜菜种植区域采集疑似根腐病的甜菜病样，症状见附录 A，记录采集时间和地点。 分离 甜菜根腐病菌分离方法见附录 B。 纯化和保存 采用单孢分离法对分离得到的镰刀菌进行纯化和保存 （见附录 B）。 5 病原菌鉴定 形态学鉴定 对纯化后的镰刀菌在 25℃培养 4 d后的菌落直径、菌落颜色、产生色素颜色、大、小型分生孢子的大 小及分隔情况、厚垣孢子的有无等几个方面进行形态学观察鉴定（见附录 C）。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 142 —2025 2 分子鉴定 采用真菌通用引物 ITS1/ITS4 对镰刀菌 rDNA -ITS区域以及针对镰刀菌保守基因设计的引物 EF1/EF2 对镰刀菌 EF-1α区域进行 PCR扩增(见附录 D)。将扩增产物连接后测序，测序结果在 NCBI和Fusarium MLST数据库中进行 BLAST比对分析，确定镰刀菌的种类。 6 病原菌致病性测定 甜菜植株培育 选取在温室中生长 6周后长势一致的甜菜植株用于致病性试验（见附录 B）。 病原菌回接、验证 6.2.1 镰刀菌孢子悬浮液制备 镰刀菌孢子悬浮液制备方法见附录 B。 6.2.2 浸根接种 浸根接种方法见附录 B。 6.2.3 病原再分离及验证 病原再分离及验证方法见附录 B。 7 结果判定 与附录 C描述的菌落及孢子等形态相似的分离物可初步判定是否为镰刀菌属。病原菌的 ITS和EF-1α 基因扩增产物与目的片段大小一致，且测序结果与数据库中镰刀菌的一致性超过 99%，可判定镰刀菌的 具体种类（见附录 D）。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 142 —2025 1 附录 A （资料性） 甜菜根腐病症状 主要症状表现为甜菜地上部分叶片叶脉间黄化，整体变色，萎蔫，最后叶片完全焦枯，与健康植株 相比明显矮小；地下部分主根尖端出现明显的黑色腐烂，维管束变褐色，根部内部组织变为浅褐色至深 褐色，边缘深棕色至黑色，最后甜菜整株坏死。 图A.1 甜菜根腐病田间症状 a A 病害前期地上部叶片萎蔫； B 地下部分主根尖端腐烂； C 左边为健康根部，右边为腐烂根部； D 根腐病危害 后田间缺苗断垄 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 142 —2025 2 B B 附录 B （资料性） 甜菜根腐病分离、鉴定及致病性测定 B.1 主要仪器和试剂 B.1.1 主要仪器 电子天平、高压灭菌锅、光学显微镜、摇床、培养箱、超净工作台、高速冷冻离心机、 PCR仪、凝 胶成像系统、电泳仪等。 B.1.2 主要试剂 氨苄青霉素、 Tris-HCl缓冲液、 EDTA溶液、醋酸钠溶液、 CTAB溶液、 TE缓冲液、 TAE缓冲液、无 水乙醇、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ PDA）、水琼脂培养基（ WA）、液体 LB培养基、固体 LB培养基； 真菌基因组提取试剂盒、 2× PCR Mix 、DNA marker （DL 2000）、 Premix Taq 、克隆载体等。 B.2 样品采集、分离、纯化和保存 B.2.1 样品采集及分离 选取症状较为典型的病根，用自来水将泥土等附着物冲洗干净并晾干。选取甜菜根部病健交界处组 织，将其切成 5 mm× 5 mm 的小块。将切好的发病组织依次用 70%乙醇浸泡 40 s，无菌水洗涤 1遍， 0.5% NaCl O浸泡 3 min，无菌水充分洗涤 3遍；然后置于灭菌滤纸上，放在超净工作台内吹干。将吹干的病块 均匀摆放于直径为 9 cm的PDA培养基（ 马铃薯葡萄糖琼脂培养基， 含有 50 μg/mL 氨苄青霉素）上，每皿 7个病块。放置于 25℃恒温培养箱中 12 h光照 /黑暗条件下培养，每天观察一次分离结果并挑取菌落转接 到新的 PDA平板上培养，观察持续到分菌后第 7 d。 B.2.2 纯化和保存 用接种针挑取少量菌丝，放入装有 1 mL无菌水的 1.5 mL Eppendorf 管中，混匀；将混匀液体吸至载 玻片上，盖上盖玻片，在 10×显微镜下，统计孢子个数，用无菌水将孢子悬浮液浓度调节至每个视野内 孢子数量为 5个～10个；取调节浓度后的孢子悬浮液 120 μL均匀涂在 1.5%的WA平板上，放于 25℃培养 8 h；在超净工作台中将培养皿开盖后置于显微镜下观察，用解剖刀切取单个萌发产生芽管的分生孢子转 移到新的 PDA平板上，置于 25℃的恒温培养箱中培养；纯化的镰刀菌在 PDA平板上充分生长后，将 PDA 平板置于 4℃下密封进行短期保存。从培养 7 d左右的菌落边缘打孔，将菌饼置于灭菌的 2 mL冻存管中并 用灭菌的液体石蜡密封进行长期保存。 B.3 致病性测定 B.3.1 甜菜植株培育 将甜菜种子用 5%NaClO 浸泡 5 min，然后用灭菌蒸馏水冲洗 3次，晾干备用。将消毒的甜菜种子播种 于装有灭菌土的花盆中，每盆 4粒，播深 2 cm，在温室中（平均温度 25℃）培育，根据花盆中土壤的含 水量平均 7 d浇一次水。约 5 d后，幼苗长出，约 30 d～40 d后，幼苗长出四片真叶。在温室中生长 6周后， 挑选长势近似的甜菜植株用于致病性试验。 B.3.2 病原菌回接、验证 B.3.2.1 镰刀菌孢子悬浮液制备 将供试镰刀菌接种于 PDA平板培养基上，于 25℃下黑暗条件下培养 7 d，取 3/4培养皿的菌饼接入装 有300 mL 液体 SNA培养基的 500 mL三角瓶内，置于 25℃， 160 rpm的摇床上培养 72 h后，将摇培液用 4 层纱布过滤，收集滤液于灭菌的 500 mL三角瓶中，用血球计数板计算孢子的浓度。用液体 SNA培养基调 整孢子浓度为 105个/mL。 B.3.2.2 浸根接种 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 142 —2025 3 采用浸根接种法，具体操作如下：取长势相近的健康甜菜苗植株，洗净根部，将植株根系浸在 105 个/mL的孢子悬浮液中浸泡 15 min，使根系与悬浮液充分接触，用液体 SNA培养基浸根的甜菜作为空白 对照。试验每处理 3次重复，每重复 10株。接种后温室遮阴 3 d缓