ICS65.020.20 CCSB15/19T/TBXJ 新疆维吾尔自治区植物保护学会团体标准 T/ZBXH131-2025 新疆野苹果腐烂病菌检测鉴定方法 DetectionandidentificationofthepathogenonMalussieversii 2025-09-20发布 2025-09-27实施 新疆维吾尔自治区植物保护学会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/ZBXH131-2025 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件中某些内容可能涉及相关知识产权保护内容，本文件的发布机构不承担相关识别等责任。 本文件由新疆农业大学农学院提出。 本文件由新疆维吾尔自治区植物保护学会归口。 本文件起草单位：新疆农业大学、中国科学院新疆地理与生态研究所。 本文件主要起草人：王丽丽、张道远、傅本重、夏红飞、马荣、施宠、张琴、杨杰。 本文件适用于新疆维吾尔自治区内所有相关单位及组织，自愿采用。 本文件由采用本标准的单位及组织自行承担相关责任。 本文件由新疆维吾尔自治区植物保护学会负责解释。 本文件为首次公布。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/ZBXH131-2025 1新疆野苹果腐烂病菌检测鉴定方法 1范围 本文件规定了新疆野苹果腐烂病菌的分离培养、致病性测定、形态学鉴定和分子生物学等检测鉴定 方法。 本文件适用于新疆野苹果腐烂病病原菌的检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T3344苹果腐烂病抗性鉴定技术规程 DB65/T4301新疆林果资源调查技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 新疆野苹果（Malussieversii(Ledeb.)Roem.） 新疆野苹果又称塞威士苹果、天山野苹果等，隶属于蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus），乔木。 产新疆西部天山野果林，是一种重要的野生果树资源，已被被列为中国濒危二级重点保护植物。 4新疆野苹果腐烂病菌基本信息 腐烂病（cankerdisease）俗称臭皮病、烂皮病，是由无性型真菌壳囊孢属（Cytosporaspp.，其有性 型为黑腐皮壳菌Valsaspp.）侵染危害树木枝干皮层和维管束系统的一种毁灭性枝干病害（症状及传播 途径参见附录A.1、A.2）。目前报道的野苹果腐烂病菌有霍氏壳囊孢（Cytosporahoffmannii）、核果壳 囊孢（Cytosporaleucostoma）、苹果壳囊孢（Cytosporamali）、寄生壳囊孢（Cytosporaparasitica）和 拟李属壳囊孢（Cytosporapruinopsis），其中，寄生壳囊孢分离频率最高，为优势病原菌（病原菌基本 信息参见附录A.3）。该病害寄主范围广，如蔷薇科樱属、苹果属、桃属、葡萄科葡萄属、杨柳科柳属、 鼠李科鼠李属、桦木科桦木属和桤木属等多种木本植物。 5仪器设备 全国团体标准信息平台 T/ZBXH131-2025 2光学显微镜、生物解剖镜、电子天平、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶 成像系统、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、培养箱、移液器。 6主要试剂及材料 病原菌分离培养所需药剂：无水乙醇、75%酒精、2%次氯酸钠溶液、无菌水、马铃薯葡萄糖琼脂 培养基（基本信息参见附B.1）。 病原菌DNA提取试剂或真菌DNA提取试剂盒：CTAB提取液（基本信息参见附录B.1）三氯甲烷， 异戊醇，异丙醇，RNase，50×TAE缓冲液、核酸染料、琼脂糖、ddH2O、DL2000DNAMaker。 7病原菌检测 7.1病原菌的分离纯化 症状检查：在解剖镜下观察感病枝条病部是否产生点状子实体形态，切取子实体于显微镜观察是否 有无色腊肠形的分生孢子。 选择表现有典型腐烂病症状的新疆野苹果枝条，将枝条病健交界处切成3mm×3mm的小块，依次 浸泡于75%酒精消毒30s，2%的次氯酸钠中浸泡3min，使用无菌水漂洗3次，利用灭菌滤纸吸除组织块 表面残留水分。将组织块接种于PDA培养基平板上，每皿4块，将其置于25℃培养箱中进行培养。恒温 培养3d~5d，待长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝置于PDA培养基平板上，重复多次以获取纯化菌株。 7.2形态学特征观察 病原菌壳囊孢属真菌形态主要观察产孢结构（子座）、分生孢子及PDA平板上菌落的形态特征。（相 关信息参见附录A.3） 7.3PCR检测 对纯化菌株进行DNA提取，多基因序列PCR扩增、测序及构建系统发育树进行序列分析。序列包 括ITS、TEF、ACT和TUB序列（相关信息参见附录B）。 7.4致病性测定 将PDA活化菌株用直径5mm的打孔器制若干菌饼备用。选取粗细均匀且健康的新疆野苹果树枝 条剪成15cm的小段，表面洗净，用75%的酒精消毒，后用无菌水冲洗并风干后，上端封石蜡，下端 放入含无菌水的烧杯中。用打孔器烫伤枝条制造伤口，将菌饼菌丝面紧贴伤口处，外覆吸有无菌水的脱 脂棉，并用保鲜膜包裹，保湿培养48h移除接种体和脱脂棉。以接种无菌PDA菌饼的枝条作为对照， 每处理设置3次重复。 接菌5d~7d后，枝条接种部位表皮初期变红褐色，逐渐出现椭圆形凹陷病斑，其表皮下韧皮部变 软并逐渐腐烂。随后，病斑呈环状扩展导致枝条缢缩，病部表面树皮逐渐变干皱缩。20d后病斑周围出 全国团体标准信息平台 T/ZBXH131-2025 3现凸起的黑色子实体（病菌产孢结构），随后逐渐扩散至整个枝条，潮湿环境其孔口会溢出橘黄色的卷 须状物，即分生孢子角。而对照枝条，除烫伤处呈褐色外，其他部位未出现变色、坏死或腐烂的症状。 对发病枝条再做病原菌分离培养，观察是否与接种菌株形态特征一致（形态特征参考附录A）。 8结果判定 综合形态学特征以及ITS、TEF、ACT和TUB多序列系统发育分析结果作为判定依据： 若植物组织症状与7.1符合，植物组织中病原菌子实体和分生孢子的形态以及分离物菌落特征符合 7.2所描述特征，同时PCR检测结果符合7.3，判定为检出新疆野苹果腐烂病病原菌霍氏壳囊孢（C. hoffmannii）、核果壳囊孢（C.leucostoma）、苹果壳囊孢（C.mali）、寄生壳囊孢（C.parasitica）和 拟李属壳囊孢（C.pruinopsis）。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH131-2025 4AA 附录A （资料性） 新疆野苹果腐烂病相关信息 A.1新疆野苹果腐烂病危害症状 新疆野苹果腐烂病是一种侵害枝干的病害，主要影响果树主干和主枝的皮层，同时也能危害幼树及 苗木，其症状表现有溃疡型和枝枯型两种。 A.1.1溃疡型 多发生于树木的主干及主要分枝部位。发病初期，病部树皮变为红褐色，略隆起，病部呈水渍状， 质地松软，常有酒糟味黄褐色液体流出，病皮极易剥离。发病后期，病部脱水凹陷，呈黑褐色，表面密 布黑色小粒点。雨后或空气湿度较大时，分生孢子器会产生橘黄色、卷须状分生孢子角。 A.1.2枝枯型 主要侵染幼嫩枝条及树势弱的大枝。发病初期，病斑呈红褐色或黑褐色，略显潮湿肿胀，很快变干、 下陷，形状不规则，切开表皮可观察到被病原菌感染而腐烂变黑的韧皮部，常在小枝长上烂一圈，造成 枝条枯死，并向下蔓延到大枝上，造成整株枯死。发病后期，病皮部会产生大量的黑色小粒点，即分生 孢子器。 图A.1新疆野苹果腐烂病病害症状（王丽丽摄） 注：A：主要分枝溃疡型病斑；B：枯死皮下病组织褐色；C：病部皱缩变干；D：产生大量小黑点 A.2传播途径 腐烂病病原菌是一种典型的弱寄生性真菌，具有潜伏侵染特性。该病菌主要以菌丝、分生孢子器、 子囊壳以及子囊孢子等形态在病残枝条上越冬，成为次年病害发生的初侵染源。野苹果树腐烂病菌侵染 全国团体标准信息平台