ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 286—2025 口蹄疫病毒与塞内卡病毒双重实时荧光 RT-PCR检测方法 Detection method of duplex real -time fluorescence RT -PCR assay for foot and mouth disease virus and seneca vally virus 2025 - 9 - 30发布 2025 - 9 - 30实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 286—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科 技有限公司、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、江苏省动物疫病预防控制中心、岳阳市动物疫 病预防控制中心、怀化市动物疫病预防控制中心、重庆市潼南区动物疫病预防控制中心、天津市动物疫 病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：于宁卫、孙雨、李晓霞、李琦、胡冬梅、宋晓晖、孙航、阚威、李静、郑思思、 林元清、张旭、王新杰、孙晓明、高姗姗、袁晓涛、徐鹏、闫新博、郑辉、王梦婕、魏若瑶、赵小平、 何海洋、丁美月、戴玉娇、李文钢、石瑜、张玉杰、沈莉萍。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 286—2025 1 口蹄疫病毒与塞内卡病毒双重实 时荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了口蹄疫病毒与塞内卡病毒双重实时荧光 RT-PCR检测方法 的原理、试剂材料、仪器用 具、样品采集处理和运输保存、样本提取、试剂制备、加样和结果判定等。 本文件适用于猪口蹄疫病毒和塞内卡病毒的 特异性核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 668 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 实时荧光 RT-PCR： 实时荧光反转录聚合酶链式反应 （ Real-time reverse transcription polymerase chain reaction） BHQ：无荧光淬灭基团（ Black hole quencher ） bp：碱基对（ Base pair） Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（ Cycle threshold ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-carboxyfluorescein ） FMDV：口蹄疫病毒 （Foot and mouth disease virus ） O-P 液：食道－咽喉部分泌物 （Oesophageal -Pharyngeal fluids ） RNA：核糖核苷酸 （Ribonucleic acid ） SVV：塞内卡病毒 (Seneca vally virus) 5 试剂材料 5.1 试剂 5.1.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 286—2025 2 5.1.2 青霉素 1000 IU/mL 5.1.3 链霉素 500 IU/mL 5.1.4 0.04 mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH 7.4），配方见 附录 A.1。 5.1.5 三氯三氟乙烷或氯仿 5.1.6 RNA提取相关试剂见附录 A.2 ~ A.5或其他等效 商品化核酸提取试剂。 5.1.7 实时荧光 RT-PCR检测试剂 为商品化试剂 。 5.2 阳性对照 含有口蹄疫病毒 靶基因片段 （参考序列见附录 B.1）、塞内卡病毒 靶基因片段（参考序列见附录 B.2） 其阳性对照 按照附录 B.3制备。 5.3 阴性对照 灭菌双蒸水，按照附录 B.4制备。 5.4 引物和探针序列 引物和探针序列见附录 C。 6 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、荧光 PCR仪、 -20 ℃低温冰箱、 pH计、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高 压灭菌锅、 生物安全柜 、可调移液器（ 2.5 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL，1000 μL）和各规格移 液器枪头、离心管、研钵等。 7 样品的采集和运输保存 7.1 样品的采集和处理要求 样品采集和处理应符合 NY/T 541 的要求。 7.2 样本的采集 7.2.1 血清样品 采集动物血液，每头应不少 于5 mL。无菌分离血清，装入 2 mL离心管中，加 盖密封后 备用。 7.2.2 组织样品 用无菌的手术刀采集病灶周围破溃组织（如舌、鼻、蹄水泡皮），也可釆集淋巴结、脊髓、扁桃体、 心脏肌肉、骨骼肌 2 g ~ 5 g装入样品保存管，加盖封口，密封备用。临床表现健康，但需做病原学检测 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 286—2025 3 的动物，可在屠宰时采集淋巴结、脊髓、扁桃体、心脏肌肉。对肉品进行病原学检测时，可采集骨骼肌。 组织样品应不少于 2 g，装入样品保存管中，密封备用。 7.2.3 水泡液样品 典型临床发病动物水泡液用灭菌注射器吸出至灭菌离心管中，加青霉素 1000 IU/mL 、链霉素 500 IU/mL，加盖封口备用。 7.2.4 O-P液样品 采样时动物站立保定， 将探杯随吞咽动作送入被检动物食道上部 10 cm ~ 15 cm处， 轻轻来回移动 2 ~ 3次，然后将探杯拉出。如采集的 O-P液被胃内容物严重污染，用水冲洗被检动物口腔后重新采样。在 10mL离心管中加 3 mL ~ 5 mL O -P液保存液，将采集到的 O－P液倒入灭菌离心管中 ，加盖封口 备用。 7.3 样品保存和运输 待检样品在 2 ℃ ~ 8 ℃ 保存不应超过 24 h。样品采集后，置于加冰袋的保温箱中，密封， 24 h内送 至实验室进行检测。 如不能立即检测， 需将样品 注明采样点名称、 样品名称、 编号及样品数量 置于 -20 ℃ 低温冰箱保存。 -20 ℃保存不超过三个月； -80 ℃以下可长期保存。 7.4 样品的处理 7.4.1 生物安全措施 样品处理的生物安全措施按照 GB 19489 进行。 7.4.2 组织样品的处理 将采集的动物机体组织 ，置组织匀浆器中充分研磨 ，加入青霉素 1000 IU/mL 、链霉素 500 IU/mL ， 0.04 mol/L 磷酸盐缓冲液 （pH 7.4）制成 1:5的组织悬液， 4℃浸毒过夜。次日以 3000×g离心 10min， 取上清液备用。 7.4.3 水泡液样品的处理 水泡液以3000×g离心 10min，取上清液备用 。 7.4.4 O-P液样品的处理 将O-P液倒入灭菌塑料离心管内，再加入不少于样品 1/3体积量的三氯三氟乙烷或氯仿。用高速组 织匀浆机以 12000×g搅拌 3 min，然后以 3000×g离心 10 min。此时液体分成两相，将上层水相分装 入样品保存管中备用。 8 样本提取 8.1 若选用附录 A中所列试剂提取 RNA，则参照以下步骤进行操作 ： a）取已处理的样品、阴性对照和阳性对照 ，分别加入裂解液 600 µ L，充分颠倒混匀，室温静置 3～ 5 min； b）瞬时离心， 将液体吸入吸附柱中， 12000×g 离心 30 s； c）弃去收集管中液体，加入 600 µ L洗涤液， 12000×g 离心 30 s； d）重复上一步骤； 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 286—2025 4 e）弃去收集管中液体， 12000×g 离心 2 min，以除去残留的洗涤液； f）将吸附柱移入新的 1.5 mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液 60 µ L； g）室温静置 2 min，12000×g 离心 1 min，离心管中液体为模板 RNA。得到的核酸模板尽量在 2h内 进行实时荧光扩增，若需长时间保存须放置 -70 ℃冰箱，但应避免反复冻融。 8.2 若使用RNA试剂盒提取 RNA，则按试剂盒说明书进行操作。也可采用其他等效的 RNA提取方 法。 9 双重实时荧光 RT-PCR反应 9.1 反应体系 口蹄疫病毒与塞内卡病毒双重 实时荧光 RT-PCR反应体系 配置见附录 D中D.1。 9.2 反应程序 口蹄疫病毒与塞内卡病毒双重 实时荧光 RT-PCR反应程序见 附录 D.2。 10 结果判定