ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国国家标准 GB/T18652—2025 代替GB/T18652—2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 MethodsfordetectionofpathogenicAeromonashydrophila 2025-08-29发布 2026-03-01实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布目 次 前言 Ⅲ ………………………………………………………………………………………………………… 引言 Ⅳ ………………………………………………………………………………………………………… 1 范围 1 ……………………………………………………………………………………………………… 2 规范性引用文件 1 ………………………………………………………………………………………… 3 术语和定义 1 ……………………………………………………………………………………………… 4 缩略语 1 …………………………………………………………………………………………………… 5 仪器设备 1 ………………………………………………………………………………………………… 6 试剂和材料 2 ……………………………………………………………………………………………… 7 检验程序 2 ………………………………………………………………………………………………… 8 样品采集、运输和保存 3 …………………………………………………………………………………… 9 细菌的分离和纯化 4 ……………………………………………………………………………………… 10 嗜水气单胞菌的鉴定 4 …………………………………………………………………………………… 11 嗜水气单胞菌致病性鉴定 6 ……………………………………………………………………………… 12 综合判定 6 ………………………………………………………………………………………………… 附录A(规范性) 培养基和试剂的配制 7 ………………………………………………………………… 附录B(资料性) 嗜水气单胞菌PCR鉴定基因的产物电泳和参考序列 9 ……………………………… ⅠGB/T18652—2025 前 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件代替GB/T18652—2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》,与GB/T18652—2002相比,除 结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 更改了范围(见第1章,2002年版的第1章); b) 增加了“缩略语”一章(见第4章); c) 增加了“仪器设备”一章(见第5章); d) 增加了“试剂和材料”一章(见第6章); e) 增加了“样品采集、运输和保存”(见第8章); f) 增加了PCR鉴定试验方法(见10.2); g) 删除了斑点酶联免疫试验(见2002年版的2.3.2); h) 增加了血平板试验(见11.2); i) 增加了综合判定(见第12章)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本文件起草单位:南京农业大学、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人:刘永杰、董雨豪、王娜、陆承平。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为: ———2002年首次发布为GB/T18652—2002; ———本次为第一次修订。 ⅢGB/T18652—2025 引 言 嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)在自然界中分布广泛,有致病菌株和非致病菌株之分。致 病菌株能感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类等动物,导致急性败血症或皮肤溃疡等局部感染。在 水产养殖上,致病性嗜水气单胞菌是引起淡水鱼细菌性败血症的主要病原。人类感染致病性嗜水气单 胞菌主要表现为急性胃肠炎。 嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒力因子密切相关,其中,胞外产物如毒素和蛋白酶在该菌致病 过程中发挥重要的作用。嗜水气单胞菌产生的毒素主要有气溶素、溶血素、细胞毒性肠毒素和细胞兴奋 性肠毒素,这些毒素属于穿孔毒素,在结构和功能上非常相似,具有相同的生物学活性,表现为溶血性、 肠毒性和细胞毒性。嗜水气单胞菌还分泌多种蛋白酶,降解酪蛋白、弹性蛋白等,对组织造成直接损 伤,也是非常重要的毒力因子。因此,凡是溶血阳性或蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌均具有致病性。通过 检测菌株的溶血活性和/或蛋白酶活性,能够鉴定嗜水气单胞菌的致病性。 ⅣGB/T18652—2025 致病性嗜水气单胞菌检验方法 1 范围 本文件描述了嗜水气单胞菌分离纯化、理化鉴定和PCR鉴定方法以及致病性嗜水气单胞菌检验的 脱脂奶平板和血平板试验鉴定方法。 本文件适用于嗜水气单胞菌和致病性嗜水气单胞菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T18088 出入境动物检疫采样 SC/T7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) gyrB:DNA促旋酶B亚单位(DNAgyraseBsubunit) PCR:聚合酶链反应(Polymerasechainreaction) TAE:三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-aceticacid-EDTAbuffer) 5 仪器设备 5.1 恒温培养箱:28℃±1℃。 5.2 干式恒温金属浴。 5.3 高速低温离心机:转速不低于12000r/min。 5.4 二级生物安全柜或超净工作台。 5.5 PCR扩增仪。 5.6 凝胶成像系统。 5.7 微量移液器:量程1μL~10μL、20μL~200μL。 5.8 核酸电泳仪。 5.9 高压灭菌锅。 5.10 冰箱(4℃、-20℃或以下)。 1GB/T18652—2025 5.11 光学显微镜(100倍物镜)。 5.12 无菌滤器:0.22μm滤膜。 6 试剂和材料 6.1 缓冲蛋白胨水,配制方法按照附录A中A.1。 6.2 普通肉汤培养基,配制方法按照A.2。 6.3 普通琼脂培养基,配制方法按照A.3。 6.4 RS琼脂培养基,配制方法按照A.4。 6.5 AHM鉴别培养基,配制方法按照A.5。 6.6 脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基,配制方法按照A.6。 6.7 血琼脂培养基,配制方法按照A.7。 6.8 糖发酵试验管,配制方法按照A.8。 6.9 Kovac试剂,配制方法按照A.9。 6.10 1×TAE缓冲液,配制方法按照A.10。 6.11 1.2%琼脂糖凝胶,配制方法按照A.11。 6.12 DNA分子质量标准(2000bp):-20℃保存。 6.13 阳性对照:嗜水气单胞菌NJ-35株(菌种保藏号CGMCCno.8319)。 6.14 gyrB基因引物:浓度为10μmol/L,扩增片段长度为435bp,序列如下: 上游引物gyrB-P1:5'-GGTCGTGGTATTCCAGTCG-3'; 下游引物gyrB-P2:5'-GCCTTCGTAGCAGAAGTGC-3'。 7 检验程序 致病性嗜水气单胞菌的检验程序见图1。 2GB/T18652—2025