ICS 67.100.10 CCS SHNX C 1441 上海奶业行业协会团体 标准 T/SHNX—004—2025 生牛乳中乳铁蛋白、 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋 白的测定 液相色谱 -串联质谱法 Determination of lactoferrin ,α-lactalbumin and β -lactoglobulin in raw milk by LC-MS/MS 2025 - 09 - 05发布 2025 - 09 - 30实施 上海奶业行业协会 发布 全国团体标准信息平台 T/SHNX 00 4—2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由上海奶业行业协会提出并归口。 本文件首期承诺执行单位：上海市农产品质量安全中心、上海市质量监督检验技术研究院、光明乳 业股份有限公司、光明牧业有限公司、上海必诺检测技术服务有限公司。 本文件起草单位： 上海奶业行业协会、 上海市农产品质量安全中心、 上海市动物疫病预防控制中心、 光明乳业股份有限公司、 上海必诺检测技术服务有限公司、上海农林职业技术学 院。 本文件主要起草人：祁兵、陈柔含、马颖清、沈秀平、邓波、周雨璊、郑小平、徐致远、朱伟、王 敏、卢洪秀、吴剑平、陈小弟、金佳伟。 全国团体标准信息平台 T/SHNX 00 4—2025 1 生牛乳中乳铁蛋白、 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白含量的测定 液相 色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了生牛乳中乳铁蛋白 、α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白的 液相色谱 -串联质谱 测定方法。 本文件适用于生牛乳中乳铁蛋白、 α-乳白蛋白 和β-乳球蛋白的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的乳铁蛋白、 α-乳白蛋白 和β-乳球蛋白经酶解作用水解成特征性肽段， 以液相色谱 -串联质谱 法测定目标蛋白的特征性肽段， 基质匹配标准曲线外标法 定量，计算试样中乳铁蛋白、 α-乳白蛋白 和β- 乳球蛋白的含量。 5 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。 5.1 试剂 5.1.1 水：GB/T 6682 ，一级水。 5.1.2 碳酸氢铵。 5.1.3 二硫苏糖醇。 5.1.4 碘代乙酰胺。 5.1.5 乙酸。 5.1.6 胰蛋白酶：序列分析纯，活力单位 ≥4 500 U/mg ，或性能相当者。 5.1.7 甲酸：色谱纯。 5.1.8 乙腈：色谱纯。 5.1.9 鸡蛋蛋清粉：食品级。 5.2 试剂配制 5.2.1 碳酸氢铵溶液（ 100 mmol/L ）：称取 0.79 g碳酸氢铵，用水溶解后 稀释至100 mL。 5.2.2 二硫苏糖醇溶液（ 500 mmol/L ）：称取 0.771 g二硫苏糖醇，用碳酸氢铵溶液（ 100 mmol/L ）溶 解后定容至 10 mL。 5.2.3 碘代乙酰胺溶液（ 500 mmol/L ）：称取 0.925 g碘代乙酰胺，用碳酸氢铵溶液（ 100 mmol/L ）溶 解后定容至 10 mL。 全国团体标准信息平台 T/SHNX 00 4—2025 2 5.2.4 乙酸溶液（ 1 %）：吸取 0.1 mL乙酸，用水稀释并定容至 10 mL。 5.2.5 胰蛋白酶溶液 （100 μg/mL）：称取 1 mg胰蛋白酶， 用乙酸溶液（ 1 %）溶解后稀释至10 mL， 现用现配 。 5.2.6 甲酸溶液（ 0.1 %）：吸取1.0 mL甲酸，用水稀释并定容至 1 000 mL。 5.2.7 甲酸乙腈溶液（ 0.1%）：吸取1.0 mL甲酸，加入 乙腈稀释并定容至 1 000 mL。 5.2.8 空白基质溶液：称取 0.10 g鸡蛋蛋清粉，用水定容至 50 mL备用。 5.3 标准品 5.3.1 乳铁蛋白标准品（ CAS号： 146897 -68-9）：纯度 ≥95%，铁含量 ≤35 mg/100g ，或经国家认证 并授予标准物质证书的标准品。 5.3.2 α-乳白蛋白标准品（ CAS号： 9051 -29-0）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的 标准品。 5.3.3 β-乳球蛋白标准品（ CAS号： 9045 -23-2）：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的 标准品。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 乳铁蛋白、 α-乳白蛋白 和β-乳球蛋白标准储备液（ 1 mg/mL）：分别称取 10.0 mg乳铁蛋白、 α- 乳白蛋白 和β-乳球蛋白标准品，用水定容至 10 mL。混匀， 0~4 ℃下保存，可保存 3个月。 5.4.2 混合标准中间液（ 200 μg/mL）：分别准确移取 2.0 mL的乳铁蛋白 、α-乳白蛋白 和β-乳球蛋白 标准储备液 于10 mL容量瓶中，用空白基质 溶液稀释 至10 mL，现用现配 。 5.4.3 标准系列工作液：吸取适量的 混合标准中间液 ， 用空白基质溶液 逐级稀释至 1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、 10.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL和200.0 μg/mL标准系列工作液，现用现配。 5.5 材料 5.5.1 1.5 mL离心管：聚丙烯材质 。 5.5.2 50 mL离心管：聚丙烯材质。 5.5.3 水相微孔滤膜： 0.22 μm，聚醚砜材质 。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱 -串联质谱仪： 配电喷雾离子源。 6.2 天平：感量 0.01 g和0.01 mg。 6.3 冷冻离心机 ：转速≥10 000 r /min。 6.4 涡旋混合 仪。 6.5 超声波仪。 6.6 恒温振荡箱或恒温 振荡水浴锅。 7 试样的制备与保存 7.1 试样的制备 取适量新鲜或解冻的生牛乳试样，搅拌混匀。 7.2 试样的保存 -18 ℃及以下保存 。 8 分析步骤 8.1 前处理 称取 2±0.02 g试样于 50 mL离心管，用水混匀，转移至 50.0 mL刻度试管，定容至刻度 。移取 200 μL 样品溶液置于 1.5 mL离心管中， 依次加入 150 μL碳酸氢铵溶液 、15 μL二硫苏糖醇溶液，混匀，于 60 ℃ 全国团体标准信息平台 T/SHNX 00 4—2025 3 恒温反应 1 h；冷却至室温，加入 30 μL碘代乙酰胺溶液，暗处静置 0.5 h，加入 50 μL胰蛋白酶溶液，混匀 后于 37 ℃恒温酶解 过夜。冷却后 加入 10 μL甲酸终止反应，静置 15 min。再加入 545 μL水，混匀， 10 000 r/min离心 5 min，取上清液过 0.22 μm水相微孔滤膜 ，供上机测定 。 8.2 标准曲线的绘制 移取 200 μL标准系列工作液置于 1.5 mL离心管中， 按照 8.1步骤处理。将标准系列工作溶液分别 注入液相色谱 -串联质谱仪中，以标准系列工作溶液中 乳铁蛋白、 α-乳白蛋白 和β-乳球蛋白 的浓度为横 坐标，对应各浓度点的定量离子峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准工作曲线，拟合回归方程，计算回 归系数。 8.3 测定 8.3.1 液相色谱参考条件 a）色谱柱： C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，300 Å），或相当者 ； b）流速：0.3 mL/min ； c）柱温： 40 ℃； d）进样体积： 10 µL； e）流动相 A：0.1 %甲酸溶液；流动相 B：0.1 %甲酸乙腈溶液。梯度洗脱参数见表 1。 表1 流动相梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A % 流动相 B % 0 95 5 1.2 95 5 2.0 80 20 3.8 70 30 4.0 0 100 4.8 0 100 5.0 95 5 7.0 95 5 8.3.2 质谱参考条件 a）电离方式： 正离子扫描 ； b）喷雾电压： 3.5 kV； c）干燥气温度： 200 ° C； d）多反应监测（ MRM）模式； e）监测离子对和碰撞能量见表 2。 表2 目标化合物的多反应监测（ MRM）条件 化合物名称 母离子（ m/z） 子离子（ m/z） 碰撞电压 （eV） 乳铁蛋白 660.8 554.3 26 698.4 23 α-乳白蛋白 600.8 355.2 30 654.4 30 β-乳球蛋白 623.3 918.4 25 460.3 32 8.4 试样测定 在相同测试条件下，试样溶液中乳铁蛋白、 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白与标准溶液中的保留时间偏差 在± 0.1 min 以内；且检测到的相对离子丰度，应与浓度相当的校正标准溶液相对离子丰度一致。其允许 偏差为 ± 40 %。乳铁蛋白、 α-乳白蛋白和 β-乳球蛋白