ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 912—2020 代替NY/T912—2004 饲料添加剂纤维素酶活力的测定 分光光度法 Determination of cellulase activity in feed additives- Spectrophotometry 2020-11-12发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 912—2020 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T912—2004《饲料添加剂纤维素酶活应的测定 分光光度法》。与NY/T912- 2004相比，除编辑性修改外主要技术变化如下 修改了适用范围（见第1章，2004年版的第1章）； 增加了定量限，删除了最低检出量（见第1章，2004年版的第1章）； 修改了DNS试剂配制后的放置时间（见5.5，2004年版的5.7)； 增加羧甲基纤维素钠试剂信息，修改了其溶液的浓度和有效期（见5.6，2004年版的5.6)； 增加了葡萄糖标准储备液有效期（见5.7)的要求； 增加了“样品”一章（见第7章）； 删除了每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线的要求（2004年版的第7章）； 修改了试样溶液制备步骤（见8.1，2004年版的第8章）； 在测定步骤中增加了试样空白溶液上机测定值处于高水平时以乙酸-乙酸钠缓冲溶液代替葡萄 糖溶液的程序（见8.2.2.3)； 修改了计算公式（见第9章，2004年版的第10章）； 修改了精密度的表述（见第10章，2004年版的第11章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：浙江省兽药饲料监察所。 本标准主要起草人：陈勇、张晓丽、任玉琴、商小金、吕伟军、陈伟良。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T912—2004。 NY/T912—2020 饲料添加剂纤维素酶活力的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了饲料添加剂中纤维素酶活力的分光光度测定方法。 本标准适用于饲料添加剂纤维素酶及其复 素酶活力的测定。 本标准的定量限为30U/g。 2规范性引用文件 PUBL 下列文件对于本文件 的应 议注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文 GB/T6682 分 析实 GB/T20195 动物 3术语和定义 S 下列术语和 适用于 3. 1 纤维素酶活力单 ellulase activity unit 在37℃、pH mg/ml的废基 溶液中降解释放 1umol还原糖所需 要的酶量 为工个纤维素酶活力 H 4原理 C 在规定的温 素降解成 赛糖和单糖具 还原性的寡糖和 单糖在沸水浴条件 反应液颜色的深浅与酶解产生的 还原糖量成正比，而 原精的 成正比 分光光度计测定反应液的 吸光度值，可计算出终 素的 5试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂 5.1水：GB/T6682，三级。 mL，加水稀释 5.3乙酸钠溶液（0.1mol/L)：称取三水乙酸钠 加水溶解并稀释至100mL，摇匀。 5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.5）：称取三水乙酸钠23.14g，加水溶解，加入冰乙酸1.70mL，用水稀 释至2000mL，用乙酸溶液（5.2)或乙酸钠溶液（5.3）调节pH至5.5，摇匀。 5.5DNS试剂：称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL搅拌，水浴至45℃，缓慢加人氢氧化钠溶液 （200g/L)100mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加人四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和亚硫 室温下放置1d后使用，有效期为6个月。 5.6羧甲基纤维素钠溶液（15mg/ml）：称取羧甲基纤维素钠（c5678)"1.5g（精确至0.001g）加乙酸 1）c5678为sigma公司的产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这些产品的认可。如果其他 产品能有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 1 NY/T 912—2020 乙酸钠缓冲溶液（5.4)80mL，磁力搅拌，同时缓缓加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解，停止加热，继续搅 拌30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4)定容至100mL，摇匀。0℃～4℃避光保存，有效期3个月。临用 前37℃水浴中平衡10min。 5.7葡萄糖标准储备溶液（10.0mg/mL）：称取无水葡萄糖对照品约0.5g（CAS号：50-99-7，含量≥ 99.5%）（精确至0.0001g），置50mL容量瓶中，加乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4）溶解并定容至刻度，摇 匀。0℃～4℃密闭保存，有效期3个月。 5.8标准系列溶液：准确量取适量标准储备溶液（5.7)于100mL容量瓶中，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (5.4）稀释定容配成系列标准溶液，浓度分别为0mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4 mg/mL.0.5 mg/mL.0. 6 mg/mL.0. 7 mg/mL。 6仪器设备 6.1分光光度计。 6.2天平：感量0.001g和0.0001g。 6.3离心机：转速不低于3000r/min。 6.4pH计：精确至0.01。 6.5电热恒温干燥箱：（103土2)℃。 6.6磁力搅拌器：附加热功能。 6.7恒温水浴锅：精确至土0.1℃。 6.8涡旋混合器。 6.9振荡仪。 7样品 按照GB/T20195制备样品，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混勾，装入磨口瓶中， 密闭保存，备用。 8试验步骤 8.1试样溶液制备 8.1.1固体样品 平行做2份试验。按附录A中建议的称样量，称取试样适量（精确至0.0001g），置于150mL具塞 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4)定容至刻度，摇匀。在0℃～4℃条件下避光放置不少于1h，摇匀，于 3000r/min离心3min，取上清液适量，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4）稀释，若稀释后酶液的pH偏离 5.5，先用乙酸溶液（5.2)或乙酸钠溶液（5.3)调节pH至5.5，再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4)定容，使得 待测酶液浓度为0.040U/mL~0.060U/mL。 8.1.2液体样品 平行做2份试验。按照附录A中建议的取样量，精密移取试样适量，置于100mL容量瓶中，用乙酸 乙酸钠缓冲溶液（5.4)定容至刻度，摇匀。用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4)稀释，若稀释后酶液的pH偏离 5.5，先用乙酸溶液（5.2)或乙酸钠溶液（5.3)调节pH至5.5，再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4)定容，使待 测酶液浓度为0.04U/mL~0.06U/mL。 8.2测定步骤 8.2.1标准曲线绘制 分别量取标准系列溶液（5.8)各2.00mL，置于刻度试管中，各加入3.0mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液 2 NY/T912—2020 （5.4)和5.0mLDNS试剂（5.5），涡旋3s。置于沸水浴中反应5min，冷却至室温，用水定容至25mL,摇 匀。以试剂空白溶液为空白对照，在540nm波长处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度值为纵 坐标，绘制标准曲线。 8.2.2测定 8.2.2.1试样空白溶液的测定 量取试样溶液2.00mL，置于具塞刻度试管中，37℃水浴中平衡10min。加入DNS试剂（5.5） 5.0mL，涡旋3s后加人羧甲基纤维素钠溶液（5.6）2.0mL，于37℃水浴保温30min，加0.3mg/mL葡 萄糖标准溶液（5.8)1.00mL，摇匀，置于沸水浴中反应5min。冷却至室温，加水定容至25mL，摇匀。以 试剂空白溶液为空白对照，在540nm波长处测定吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样空白反应溶液 上机浓度co。 8.2.2.2试样溶液的测定 量取试样溶液2.00mL,置于具塞刻度试管中，37℃水浴中平衡10min。加人羧甲基纤维素钠溶液 （5.6)2.0mL，涡旋3s后37℃保温30min，加人DNS试剂（5.5)5.0mL，涡旋3s，以终止酶解反应，加 0.3mg/mL葡萄糖标准溶液（5.8)1.00mL，摇匀，置于沸水浴中反应5min，冷却至室温，加水定容至 25ml，摇匀，以试剂空白溶液为空白对照，在540nm波长处测定吸光度值，用标准曲线回归方程计算出 试样反应溶液上机浓度c。 8.2.2.3Co值处于高水平时葡萄糖溶液的调整 若co≥0.35mg/mL且c超出标准曲线范围，用1.00mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（5.4)代替上述测定 中的0.3mg/mL葡萄糖标准溶液（5.8）。 9试验数据处理 试样中纤维素酶活力以X计，数值以酶活力单位每克（U/g)或酶活力单位每毫升（U/mL)表示。按 式（1）计算。 mXtX180.2 (1) 式中： c 试样反应溶液中葡萄糖的上机浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； Co 试样空白反应溶液中葡萄糖的上机浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； n 试样溶液定容后的稀释倍数； m 试样质量，单位为克（g)或毫升（mL）； 酶反应时间，单位为分钟(min)； 100 试样定容体积，单位为毫升（mL）； 180.2- 葡萄糖摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)； 1000- 转化因子，1mmol等于1000μmol。 平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。 10精密度 在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的8%。 3 NY/T912—2020 附录 A (规范性附录） 建议取样