ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 571—2018 代替NY/T571—2002 马腺疫诊断技术 Diagnositc techniques for strangles 2018-03-15 发布 2018-06-01 实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 571—2018 目 次 前言 引言 范围. 规范性引用文件 临床检查 4 细菌学检查 5综合判定 附录A(规范性附录) 溶液的配制 附录 B(资料性附录) PCR 扩增产物参考序列 NY/T 571—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T 571—2002《马腺疫诊断技术》。与NY/T571—2002相比,除编辑性修改外主 要技术变化如下： “引言”部分更正马腺疫为三类动物疫病； 增加了对病原菌进行鉴定的PCR方法（见4.5)； -对病原菌分离培养基进行调整（见4.3.3,附录A）。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAT/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：王晓钧、郭巍、戚亭。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T571—2002。 I NY/T 571—2018 引 言 马腺疫是马、驴、骤的一种急性传染病，该病以症状命名,典型症状为发热、上呼吸道及咽喉黏膜呈 现卡他性炎症，颌下淋巴结表现急性化脓性炎症，幼驹最易感染。病原体为C型链球菌马链球菌马亚 种(Streptococcus equi subspecies equi,S. 我国《一、二、三类动物疫病病种名录》（中华人民共和国农业部公 第1125号)将该病确定为三 类动物疫病。 NY/T 571—2018 马腺疫诊断技术 1范围 本标准规定了马腺疫临床检查、细菌学检查和综合判定的技术要求。 本标准适用于马、驴、骤等马属动物马腺疫的诊断。 2规范性引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 括所有的 食品安全国家标准 食品微生物 溶血性链球 GB 4789.11 检验 求菌检验 GB 4789.28 食品安全国家标准 量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方 NY/T 541 兽医诊断样 品采集保 S 3 临床检查 3.1器材 A 体温计、马保定架胶 3.2消毒药 U 根据情况 洁尔灭 毒药选择 可 一种使用。 3.3检查方法 保定被检马， 3.4临床特征 3.4.1一过型腺疫 R 鼻腔黏膜潮红 鼻液 颌下淋巴结轻度肿胀 3.4.2典型腺疫 体温39℃～41℃,鼻腔流出黏性至脓性鼻液。 颌下淋巴结肿大 表面凹凸 平，触之硬实，界限清 楚,如鸡蛋大甚至拳头大。 周围发生炎症时肿胀加剧，充满整个下颌间隙 限不清，热痛明显。随着 炎症的发展,局部组织肿胀化脓,肿胀完全成熟， 自行破溃，流出大量黄 黏稠脓汁。随后，创内肉芽 组织新生,逐渐愈合。病程2周 6月龄～12月龄幼驹最易感染本病。 3.4.3恶性型腺疫 如果病马抵抗能力很弱，则马链球菌可由颌下淋巴结的化脓灶转移到其他淋巴结,形成化脓灶，甚 至转移至肺和脑等器官,发生脓肿，体温多稽留不降，常因极度衰弱或继发脓毒败血症死亡。 3.4.4临床判定 符合3.4.2～3.4.3描述的临床症状，可诊断为马腺疫。 4细菌学检查 4.1 病料标本采集 按照NY/T541的规定，用消毒药（3.2）对病马颌下淋巴结未破溃脓肿进行消毒，然后用注射器刺 NY/T 571—2018 脓肿，吸取脓汁注人灭菌小试管中。如果脓肿已经破溃,则用灭菌生理盐水浸湿的棉棒蘸取脓汁或鼻 腔分泌液放于灭菌小试管中，立即检查，或放4℃冰箱中保存待检。 4.2直接镜检 4.2.1器材 显微镜、载玻片。 4.2.2操作方法 将病料标本涂于载玻片上，干燥，固定，进行革兰氏染色（见附录A)。 4.2.3显微镜观察 在显微镜下先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察。 4.2.4菌体形态特征 马链球菌的形态及染色特征是在脓球间散布着由几个甚至上百个球菌组成的波浪状弯曲的长链 条,各菌大小不等,多呈扁球状,直径约1μm,菌体着色不均,革兰氏阳性。 4.3分离培养 4.3.1器材 恒温箱、镊子、铂金耳、酒精灯。 4.3.2试剂 符合GB4789.11、GB4789.28规定的糖发酵管。 4.3.3培养基 10%血清肉汤、THB培养基、5%~10%血清琼脂平板、哥伦比亚血琼脂平板配制方法见附录A。 4.3.4操作方法 用铂金耳钩取病料,接种于10%血清肉汤或 THB培养基做增菌培养,接种于 5%～10%血清琼脂 或哥伦比亚血琼脂平板做分离培养,于37℃恒温箱中孵育 24 h～72h。 4.3.5结果观察 4.3.5.1血清肉汤或 THB培养基 培养后，生成长链条状，24h肉汤轻度混浊，48h后长成长链条状的菌体缠绕体，呈棉絮状沉淀于试 管底，72h后上清液清朗。 4.3.5.25%~10%血清琼脂 平板上形成圆形、透明、闪光、中央微隆起、表面光滑的露珠样小菌落。强毒株的菌落表面常呈颗粒 状结构，用放大镜观察更为明显。 4.3.5.3哥伦比亚血琼脂 平板上发生β型溶血，即在露珠状小菌落周围形成界限分明、完全透明的溶血带，该带的宽度可达 2 mm~3 mm 以上。 4.4生物化学特性 4.4.1试剂 糖发酵管、生化培养基、链球菌生化鉴定试剂盒或鉴定卡。 4.4.2操作方法 挑取符合4.3.4特征的菌落，接种于GB4789.28中规定的糖发酵管和生化培养基上，于37℃孵育 72 h。 按照GB4789.11的规定，可使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。 4.4.3结果观察 4.4.3.1糖发酵试验 2 NY/T 571—2018 发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、单奶糖、水杨苷等,产酸不产气；不发酵蕈糖、山梨醇、甘露醇、 乳糖。 4.4.3.2生化试验 不分解马尿酸钠；不还原硝酸盐；不还原美蓝牛乳；在胆汁中不被溶解。 4.4.3.3使用链球菌生化鉴定试剂盒应根据相应的链球菌生化编码鉴定手册得出鉴定结果。 4.4.3.4结果判定 符合4.4.3.1、4.4.3.2、4.4.3.3特征，则判定分离菌为马链球菌马亚种阳性。 4.5马链球菌 PCR鉴定 4.5.1仪器设备 PCR仪、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统。 4.5.2试剂与引物 市售细菌DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、核酸染料、琼脂糖。 可采用引物F27/R1492用于马链球菌核酸的检测，见表1。 表 1用于马链球菌 PCR检测的引物 引物 目的 序列（5～3'） 产物 F27 正向引物 AGAGTTGATCCTGGCTCAG R1492 1. 5 kb 反向引物 AAGGAGGTGATCCAACCGCA 4.5.3细菌DNA的提取 可使用市售细菌DNA提取试剂盒提取采集的脓汁、鼻拭子或单菌落培养扩增菌液的DNA。提取 的 DNA立即进行 PCR反应或一20℃保存。 4.5.4PCR条件 95℃预变性5min;95℃变性40s,56℃退火40s，72℃延伸1min40s，共30个循环；72℃再延伸 5min。反应结束。 4.5.5PCR扩增产物电泳鉴定 将PCR产物在混有核酸染料的1%琼脂糖凝胶中电泳,在约1.5kb处出现明显单一条带,即为阳 性产物，可用于测序。 4.5.6PCR扩增产物测序鉴定 将PCR产物进行测序,通过序列比对(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与参考序列(参 见附录B)相似度不低于99%为阳性,可判定分离菌为马链球菌马亚种。 4.6细菌学判定 符合4.4.3和4.5.6所述，可判定病料或分离菌中马链球菌马亚种阳性。 5综合判定 符合3.4.4所述，可判定动物患马腺疫。符合4.6所述，可判定病料或分离菌中马链球菌马亚种 阳性。 3