ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 536—2017 代替NY/T536—2002 鸡伤寒和鸡白痢诊断技术 Diagnostic techniques for fowl typhoid and pullorum disease 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 536—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T536—2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》。与NY/T536—2002相比，除编辑性 修改外,主要技术变化如下： 增加了鸡伤寒和鸡白的临床诊断和病理变化(见第2章); 增加了鸡沙门菌和维沙门菌鉴别PCR(见3.1.3.4)。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：康凯、李伟杰、陈小云、赵耘、岂晓鑫、张敏。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T 536—2002。 I NY/T 536—2017 引 言 鸡伤寒和鸡白痢(fowl typhoid and pullorum disease)分别是由鸡沙门菌(Salmonella gallinarum） 和雏沙门菌(Salmonella pullorum)引起的鸡和火鸡等的传染病,是危害我国养鸡业的重要疾病。我国 将鸡白痫列为二类动物疫病,世界动物组织[World Org ganization for Animal Health（英）， Office In- ternational des Epizooties(法）,OIE］在“Manual of Diagnostio Tests and Vaccines for Terrestrial Animals,2016"中规定了鸡伤寒和鸡白痢诊断标准和相应生物制品（多价抗原)的制造、标定和使用的国 际标准。 PUBL for Terrestrial Animals , 2016" 中的2.3.11章“FOWL TYPHOID AND ,建立了鸡沙门菌和 维沙门菌的鉴别PCR方汽 并在夏核 去， 核验证的基础 F ，对《鸡伤寒 2002)进行了修订,增加了鸡门菌和维 沙门菌鉴别的双重 PCI 同时参考《兽医传染病学》（第 五版,陈溥言主编）， 天诊断和病理变化等内容 S NY/T 536—2017 鸡伤寒和鸡白痢诊断技术 1范围 本标准规定了鸡伤寒和鸡白痢诊断的技术要求 本标准所规定的临床诊断和实验室诊断适用于各种日龄鸡的鸡沙门菌和雏沙门菌感染的诊断。其 中,PCR方法可用于鸡沙门菌和雏沙门菌的鉴别,全血平板凝集试验适用于成年鸡的鸡沙门菌和雏沙 门菌抗体的检测。本标准也可用于鸡伤寒和鸡白痢的流行病学调查和健康鸡群监测。 2 临床诊断 2. 1 临床症状 2. 1. 1 鸡伤寒临床症状 成年鸡易感，一般呈散发性。潜伏期一般为4d～5d。在年龄较大的鸡和成年鸡，急性经过者突然 停食,排黄绿色稀粪,体温上升1℃～3℃。病鸡可迅速死亡,通常经5d～10d死亡。维鸡发病时,临诊 症状与鸡白痫相似。 2. 1. 2鸡白痫临床症状 各品种鸡对本病均易感,以2周龄～3周龄维鸡的发病率和死亡率为最高,呈流行性。本病在雏鸡 和成年鸡中所表现的症状和经过有显著的差异。 a）雏鸡潜伏期4d～5d,出壳后感染的雏鸡,多在孵出后几天才出现明显临诊症状,在第2周～第 3周内达到高峰。发病鸡呈最急性者,无临诊症状迅速死亡。稍缓者表现精神委顿,绒毛松 乱，两翼下垂，缩颈闭眼，昏睡，不愿走动，拥挤在一起。病初食欲减少，后停食，多数出现软嗪 临诊症状。腹泻,排稀薄如糊状粪便。有的病维出现眼盲或肢关节肿胀,呈跛行临诊症状。 b）成年鸡感染后常无临诊症状,母鸡产蛋量与受精率降低。有的因卵黄囊炎引起腹膜炎，腹膜增 生而呈“垂腹”现象。 2. 2 病理变化 2.2. 1鸡伤寒病理变化 死于鸡伤寒的雏鸡病理变化与鸡白痢相似。成年鸡,最急性者眼观病理变化轻微或不明显,急性者 常见肝、脾、肾充血肿大。亚急性和慢性病例,特征病理变化是肝肿大呈青铜色,肝和心肌有灰白色粟粒 大坏死灶,卵子及腹腔病理变化与鸡白痫相同。 2. 2. 2鸡白痫病理变化 a）维鸡急性死亡,病理变化不明显。病期长者,在心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶 或结节,胆囊肿大。输尿管扩张。盲肠中有干酪样物，常有腹膜炎。稍大的病维有出血性肺 炎,肺有灰黄色结节和灰色肝变。育成阶段的鸡肝肿大，呈暗红色至深紫色，有的略带土黄色， 表面可见散在或弥散性的小红色或黄白色大小不一的坏死灶，质地极脆，易破裂，常见有内出 血变化。 b）成年母鸡最常见的病理变化为卵子变形、变色,呈囊状。有腹膜炎及腹腔脏器粘连。常有心包 炎。成年公鸡睾丸极度萎缩，有小肿胀,输精管管腔增大，充满稠密的均质渗出物。 3实验室诊断 3.1病原分离和鉴定 1 NY/T 536—2017 3.1.1采集病料 可采集被检鸡的肝、脾、肺、卵巢等脏器,无菌取每种组织5g～10 g,研碎后进行病原分离培养。 3.1.2分离培养 3. 1.2. 1培养基 增菌培养基：亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基。 鉴别培养基：SS琼脂和麦康凯琼脂。 以上各培养基配制方法见附录A。 3.1.2.2操作 将研碎的病料分别接种亚硒酸盐煌绿增菌培养基或四硫磺酸钠煌绿增菌培养基和SS琼脂平血或 麦康凯琼脂平血,37℃培养24h～48 h,在 SS琼脂或麦康凯平 平皿上若出现细小无色透明或半透明、圆形 养基上划线分离，37℃培养24 3.1.3病原鉴定 3.1.3.1生化试 3. 1. 3. 1. 1 生化反应试剂又 三糖铁琼脂和半固体琼 S 3. 1.3. 1.2操作 将可疑菌落穿刺接种 糖铁琼脂斜面，并在斜面上划线，同时接种半固体 ，37℃培养24h后 A 观察。 3. 1. 3. 1. 3 若无运动性 并且在 鸡沙门菌或雏沙 门菌感染 糖铁琼脂典型阳性反应为斜面产碱、变红，底层 酸、变黄;部分菌株斜面 CEN 和底层均产酸、变黄 脂阳性反应为穿刺线呈= 3.1.3.2血清型鉴 3.1.3.2.1沙门菌属诊断血清 沙门菌 A-F 多价血 1清、012因了 子血清H a因子血清 P 1 因子血清、H-g.m 因子血清和 H- g. 3.1.3.2.2操作 对初步判为沙门菌的培养物做血清型鉴 斜面，37℃培养18h~ 24 h,先用 A-F 多价 O 血清与培养物进行平板凝集试验,若呈阳性反应,再分别用 O9、O12、H-a、H- 具体操作如下：用接种环取两环因子血 1清于洁净玻璃板上 ,然后再用接种环取少量被检菌苔与血清 混匀,轻轻摇动玻璃板，于1 min内呈明显凝集反应者为阳性,不出现凝集反应者为阴性。试验同时设 生理盐水对照，应无凝集反应。 3.1.3.2.3结果判定 如果培养物与 O9、O12因子血清均呈阳性反应,而与 H-a、H-d、H-g.m 和 H-g.p因子血清均 呈阴性反应，则鉴定为鸡沙门菌或雏沙门菌。 3.1.3.3鸡沙门菌和雏沙门菌初步鉴别生化试验 3.1.3.3.1生化反应试剂 鸟氨酸脱羧酶试验小管、卫茅醇试验小管和葡萄糖(产气)小管。 3.1.3.3.2操作 2 NY/T 536—2017 对鉴定为鸡沙门菌或维沙门菌的菌株接种鸟氨酸脱羧酶、卫茅醇和葡萄糖(产气)生化小管,37℃培 养24h后观察。 3. 1.3. 3.3结果判定 鸟氨酸脱羧酶和葡萄糖(产气)为阴性,卫茅醇为阳性的为鸡沙门菌;鸟氨酸脱羧酶和葡萄糖(产气) 为阳性，卫茅醇为阴性的为雏沙门菌。 3.1.3.4鸡沙门菌和维沙门菌鉴别PCR 3. 1.3. 4.1 PCR 试剂 10 X PCR Buffer、dNTP、Taq 酶、DL2000 NAMar 、TAE、琼脂糖、阳性对照（已鉴定的鸡沙门 菌和雏沙门菌)和阴性对照。 3.1.3.4.2引物 见表1。 和沙门菌 检测目的基因 物序列 扩增大小(bp) gl 上游 物：GATCTGCTGCCAGCT glgC 基因 174 C下游引物：GCGC TT AAAACATA speC上游引物：CGGTG TAC TAT speC基因 S 252 speC下游引物 CTGGG CAT ITGACGCAAA 3. 1.3. 4.3 DNA 的提取 取纯培养细 种环加人100μL 菌超纯水中，混 10 min, 2000r/min 离心1 min, 清 用扩增的模板 3. 1. 3. 4. 4 CR 见表2。 鸡沙门菌和雏沙门菌鉴 JPCR 反应体系 无菌超纯水 R 10 X PCR Buffer(含 dNTP(2. 5 mmol/ L glgC上游引物(10 μm glgC下游引物(10 μmol speC上游引物(10 μmol/ L speC下游引物（10μmol/L) Taq酶(5U/μL) 0.25 DNA模板 2 同时设置阳性对照和阴性对照。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,30个循环,72℃延伸7min。 3.1.3.4.5PCR产物的检测 PCR产物用1.5%～2.0%琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增产物条带大小。 3.1.3.4.6结果判定 阳性对照扩增出约174bp和252bp的片段，阴性对照未扩增出片段，试验成立。若被检样品扩增 出约174bp和252bp的片段，判定为鸡沙门菌；若被检样品只扩增出约252bp的片段，判定为