ICS 11.220 CCS B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 40422021 水貂病毒性肠炎诊断技术 Diagnostic techniques for mink viral enteritis 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T4042—2021 目 次 前言 引言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4. 缩略语· 5 临床诊断 5.1 流行特点 5. 2 临床症状 5.3 病理变化 6样品采集及处理 6.1 仪器. 6.2耗材.. 6.3试剂.. 6.4 样品处理 7病原分离鉴定 7. 1 仪器.. 7. 2 耗材· 7. 3 试剂 7. 4 样品处理 7. 5 病毒分离鉴定 血凝和血凝抑制实验(HA-HI) 8.1 仪器 8.2 耗材 8.3 试剂· 8. 4 HA实验操作方法 8.5 HI实验操作方法 8.6 质控标准 8.7 结果判定 9 PCR检测 9. 1 仪器. 9. 2 耗材· 9.3 试剂 9. 4 DNA提取 9.5 PCR检测 9. 6 质控标准 9.7 结果判定 10 荧光PCR检测 10.1 仪器 10.2 耗材 I NY/T 4042—2021 10.3 试剂 10.4 DNA提取 10.5 荧光PCR反应体系 10.6荧光PCR反应参数 10.7 质控标准· 10.8结果判定 11综合判定 附录A(资料性） 水貂病毒性肠炎病例腹泻物特征图 附录B(资料性) 磷酸盐缓冲液配制 附录C(资料性） 水貂肠炎病毒分离鉴定相关溶液配制· 附录D(资料性） HA-HI实验相关溶液配制及判定结果示意图 附录E（资料性） PCR检测引物及溶液配制 附录F(资料性) 实时荧光PCR扩增引物、探针、扩增序列 IⅡI NY/T 4042—2021 全国农业食品标准 公共服务前 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院特产研究所、吉林大学、佛山科学技术学院、中国兽医药品监察所、 中国动物卫生与流行病学中心、长春海关 本文件主要起草人：张海玲、闫喜军、胡博、刘昊、白雪、卢士英、王洋、张蕾、赵传芳、程悦宁、章沙沙、朱 言柱、张东亮、印春生、王君玮、廉士珍、王伟利、赵建军、鲁荣光、徐磊。 NY/T4042—2021 人神品育业求国全 引言 水貂病毒性肠炎（Minkviralenteritis）是由水貂肠炎病毒（Minkenteritisvirus，MEV，也称为水貂细 小病毒)引起水貂（Neouisonvison)的一种急性、高度接触性传染病，以剧烈腹泻为主要临床特征。自20 世纪40年代末开始，水貂病毒性肠炎呈世界性暴发，我国首发于1980年。在自然条件下，不同品种和不 同年龄的水貂均易感，幼貂易感性极强，发病率50%～60%，病死率最高可达90%，给水貂养殖业造成巨 大经济损失。 IV NY/T 4042—2021 水貂病毒性肠炎诊断技术 1范围 本文件规定了水貂病毒性肠炎临床诊断、病原分离鉴定、血凝-血凝抑制实验（HA-HI)、PCR检测和 实时荧光PCR检测操作方法的技术要求。 本文件适用于水貂病毒性肠炎的临床诊断、检疫、监测和流行病学调查。 2规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 括所有的修改单）适用本文件。 GB/T6682 分析实 NY/T541 兽医诊断样品头 3术语和定义 要界定的 本文件没 有品 语和货 4缩略语 下列缩略语 适用子 MEV：水貂用 肠炎病毒 2 MEM：最低 营养需 CRFK: 细胞1C CPE：细胞 病 变效立 Cytopathicel HA-HI:血凝 gglutinat -hema PCR：聚合 式反应 Ct：循环阈值（ 5临床诊断 5.1流行特点 5.1.1各年龄段、各品系的水 召均易感 貂量 5.1.2发病和带毒水貂是本病主要 专染源， 5.1.3消化道是本病主要传播途径 等直接传播：又可通过尿液、睡液等向体外排毒 污染饲料、饮水及圈舍饲养环境间接传播；也可通过流动人员、运输设备、工具、鸟类、鼠类和昆虫媒介机械 传播。 5.1.4具有季节性，常在8月～9月发生，此时正是仔貂分窝及其母源抗体处于较低水平时期，容易引起 大规模暴发流行，冬季散发。 5.2临床症状 5.2.1本病潜伏期4d~8d,病程1d~14d不等。 5.2.2精神沉郁，食欲减退或废绝，部分水貂出现呕吐等症状。 5.2.3大部分水貂体温升高达40℃以上（包括40℃），有的体温升高持续2d以上。 5.2.4出现腹泻，排出混有血液、黏液的水样便或混有肠黏膜的稀便，呈黄色、绿色或灰白色，有的出现灰 白色或粉红色管型便（见附录A），伴有刺鼻腥臭气味。 1 NY/T4042—2021 5.3病理变化 5.3.1肝、脾、肾和肠系膜淋巴结肿大；胃、肠道及肠系膜淋巴结出血，肠黏膜脱落；肠胀气，肠壁变薄，内 容物呈黑绿色或红色，部分发生脑出血。 5.3.2部分淋巴小结变性和坏死，淋巴细胞显著减少，脾脏小动脉周围淋巴细胞减少。肝脏小叶周边肝 细胞变性，变性肝细胞的胞浆内含有空泡。 5.3.3十二指肠、空肠和回肠绒毛萎缩、钝化，绒毛和隐窝上皮细胞脱落，隐窝扩张。 6样品采集及处理 6.1仪器 6.1.1微量移液器（200μL~1000μL)。 6.1.2天平。 6.1.3高压蒸汽灭菌锅。 6.1.4组织匀浆机或研磨皿。 6.1.5高速冷冻离心机（转速≥12000r/min）。 6.1.6生物安全柜。 6.1.7-80℃冰箱。 6.1.8-20℃冰箱。 6.2耗材 6.2.1吸头（200μL~1000μL)。 6.2.25mL离心管。 6.2.3剪刀。 6.2.4镊子。 6.2.5棉拭子。 6.3试剂 6.3.1除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682分析实验室用水规格。 6.3.2磷酸盐缓冲液(0.015mol/L,pH6.4)(见附录B)。 6.3.3三氯甲烷（氯仿）。 6.4样品处理 6.4.1除特别说明以外，本文件样品采集应符合NY/T541的规定。 6.4.2采集样品包括发病和病死水貂的肠道组织、肠内容物、肠系膜淋巴结、粪便或直肠拭子。 6.4.3用无菌镊子和剪刀取发病和病死水貂肠内容物、肠道组织、肠黏膜、肠系膜淋巴结或粪便样品1g， 加5倍体积的磷酸盐缓冲液，用组织匀浆机或研磨血研磨乳化制成乳剂，一20℃冰箱反复冻融3次，振荡 混匀后3000r/min离心10min，取上清液一80℃冰箱保存备用。 6.4.4用无菌棉拭子轻轻旋转插入发病水貂直肠2cm～4cm刮取内容物，直肠拭子放入离心管，用 2mL磷酸盐缓冲液浸润后，3000r/min离心10min，取上清液一80℃冰箱保存备用。 6.4.5用微量移液器吸取6.4.3、6.4.4处理溶液，加等体积氯仿充分振荡混匀，12000r/min离心 15min，吸取上层液相冻存一20℃保存备用。 注：以上操作均在生物安全柜中进行。 7病原分离鉴定 7.1仪器 2